本发明属于农业领域，具体涉及利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法。
背景技术：
豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界效率最高的固氮体系。农业生产中所栽培的豆科植物品种繁多，而不同豆科植物品种与根瘤菌株间存在共生匹配专一性，即某一根瘤菌株仅能与特定豆科植物基因型高效结瘤固氮。苜蓿品种与根瘤菌株的促生效应具有明显的对苜蓿品种和根瘤菌株专一性共生的依赖性，不同根瘤菌株与苜蓿品种共生根瘤对植株生长产生的增产效应差异明显。因此，快速、精准的鉴定共生专一性，以实现根瘤菌株与苜蓿品种的高效匹配，是提高共生系统促进生长效应的重要途径。
目前，对于苜蓿-根瘤菌共生专一性效应的鉴定缺乏精准和快速简便的方法。通常采用田间苜蓿品种接种根瘤菌株，测定共生表型指标的方法筛选高效的共生组合，且在共生表型指标的选择和测定方法上缺乏统一规范和标准，存在受环境条件影响大、结果可靠性低等问题；同时，虽然占瘤率、結瘤数量、固氮酶活性、固氮量、株高和生物量等指标被大多数人所采用，但是由它们衡量的共生效应往往与实际结果存在不一致性，缺乏有效的指导意义。在分子技术应用方面，有关根瘤菌共生效应的研究，主要集中在结瘤因子与固氮酶合成及调控关键基因等方面，但尚未应用到苜蓿-根瘤菌的专一性效应方面。而转录组学技术已经被用于研究紫花苜蓿与根瘤菌的互作，不仅可以用于寻找差异基因和精确分析苜蓿品种与根瘤菌株专一性高效共生的分子机理，还可以利用转录组学技术鉴定苜蓿品种与根瘤菌株的专一性共生效应，可以从基因簇、注释蛋白和代谢通路等角度更加直观的体现苜蓿品种和根瘤菌株共生互作的有效性，为精准构建苜蓿与根瘤菌高效共生体、提高苜蓿产量和质量提供路径。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，有效的解决了上述背景技术中存在的问题。
本发明采用的技术方案如下：
利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，包括以下步骤：
s1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；
s2、制备根瘤菌液，将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；
s3、接种根瘤菌株，将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；
s4、样品采集，将收获的紫花苜蓿植株处理后随机选取若干株，采集紫花苜蓿植株的毛根处理后保存；
s5、总rna提取，采用总rna提取试剂盒根据trizol法提取紫花苜蓿植株的毛根组织总rna；
s6、对总rna的质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性；
s7、cdna文库构建及上机检测，以提取和检测的总rna样品为材料，用带有oligo(dt)的磁珠富集真核生物mrna；
s8、转录本denovo组装和基本注释，对检测数据处理得到高质量的cleanreads，并进行转录本denovo拼接组装和基本注释；
s9、对cleanreads进行基因差异表达分析；
s10、通过基因差异表达分析，实现对专一性共生结瘤效应确定。
所述s4中，收获的紫花苜蓿植株处理方式和紫花苜蓿植株的毛根处理方式为：根瘤菌液接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分，随机选取，采集苜蓿植株的毛根并混匀，用锡箔纸包裹，并在泡沫盒内迅速用液氮冷冻，保存备用。
所述s4中，样品的采集部位包括毛根和根瘤。
所述s5还包括：
s501、向毛根组织和根瘤的混合物中加入液氮，迅速研磨至粉末，加入sl和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀并离心处理；
s502、将上清液转至过滤柱cs中，离心处理，转移上清液至新的rnase-free离心管中；
s503、加入无水乙醇，混匀后转入吸附柱cr3中，离心处理，弃废液；
s504、将去蛋白液rw1加入吸附柱cr3中，离心处理，弃废液；
s505、将dnasei储存液加入新的rnase-free离心管中，再加入rdd溶液，轻柔混匀；
s506、将dnasei工作液加入吸附柱cr3中央，室温静置；
s507、将去蛋白液rw1加入吸附柱cr3中，离心处理，弃废液；
s508、将漂洗液rw加入吸附柱cr3中，离心处理，弃废液，重复处理；
s509、将s508中的cr3吸附柱离心处理后，转移至新的rnase-free离心管中，将rnase-freeddh2o悬空滴入吸附膜中部，室温静置，并离心处理，收集rna溶液；
s5010、取适量rna进行浓度测定并进行琼脂糖电泳检测，并保存。
所述s6总rna的质量检测包括采用nanodrop超微量紫外分光光度计和2％琼脂糖凝胶电泳定量检测rna条带，再利用agilent2100生物分析仪进行rna样品质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性，其余保存备用。
所述s7中，cdna文库构建及上机检测包括：
s701、以短片段mrna为模板，用六碱基随机引物合成第一条cdna链；
s702、利用dntps、缓冲液、dnapolymerasei和rnaseh合成第二条cdna链；
s703、通过qiaquickpcr试剂盒纯化、eb缓冲液洗脱、末端修复、加poly(a)和连接测序接头；
s704、采用琼脂糖凝胶电泳选择长度为150～200bp的片段；
s705、采用phusion高保真度dna聚合酶、通用pcr引物和index(x)引物进行pcr扩增，并用agilent2100生物分析仪检测扩增产物质量；建好的cdna测序文库用illuminanovaseq6000平台进行测序。
所述s8中，转录本denovo组装和基本注释包括：
s801、利用fastqc(v0.11.5)对测序得到的原始数据进行质控，滤去含adapter、n比例>10％以及低质量的reads，获得高质量的cleanreads；
s802、通过碱基组成、质量值分布图和饱和度分析检测数据质量情况；
s803、使用trinity(v2.2.0)组装软件对过滤后的高质量cleanreads进行转录本denovo拼接组装，后进行转录本聚类，取最长转录本为unigene，最后通过n50数值和序列长度来评估组装结果质量；
s804、采用blast+(v2.4.0)将转录本注释到nr、cog/kog和kegg数据库；
s805、利用blast2go(v2.3.5)软件进行go注释。
所述s9中，基因差异表达分析包括采用edger软件(v3.14.0)进行差异基因分析，基因的表达量用fpkm值表示。错误发现率≤0.05且|log2fc|>1为筛选差异基因的条件，以表达差异倍数≥2或≤0.5表示表达上调或下调，在转录组比较组合中选取差异基因；通过比对go数据库对差异基因进行功能注释和显著性富集分析；通过比对kegg数据库，对差异基因参与的细胞代谢途径及其产物功能进行系统分析。
所述s10中，专一性共生结瘤效应确定方式为：多个根瘤菌株接种于同一个苜蓿品种，对比每两两组合间的差异基因数量，小于或等于苜蓿总基因组的0.5％时，确定为此菌株与该苜蓿品种专一性弱，表明此根瘤菌株对该苜蓿品种促进生长能力弱；差异基因数量大于或等于苜蓿总基因组的12.2％时，确定为专一性强，表明此根瘤菌株对该苜蓿品种促进生长能力强。
本发明的有益效果为：
1)利用转录组学鉴定专一性共生结瘤效应，摆脱了对共生表型指标的依赖，避免了受环境条件影响而导致结果可靠性低的问题。
2)转录组学技术成熟，操作规范，标准化程度高，结果稳定可靠，易于普及应用。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步的说明本发明的技术方案：
实施例1
利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，包括以下步骤：
1)苜蓿品种：甘农3号紫花苜蓿(m.sativacv.gannongno.3)、甘农9号紫花苜蓿(m.sativacv.gannongno.9)、陇中紫花苜蓿(m.sativacv.longzhong)和清水紫花苜蓿(m.sativacv.qingshui)。
2)根瘤菌株：6株中华根瘤菌(s.meliloti)：ll2、wlp2、ql2、ll1、g3l3和lp3。
3)培育幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用碘伏溶液(有效碘含量0.45％～0.55％(w·v-1))震荡灭菌3min，用无菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h。将河沙洗净，过筛(2-mm)，ph调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却。在直径13.2cm、高10cm的塑料盆中装入河沙450g，并均匀植入60粒种子发芽，深度为2cm。之后将塑料小盆放入29cm×20cm×9.5cm的塑料面盆中，每个面盆内放2个小盆，并浇灌500ml灭菌水。培养条件为：光照时间16h·d-1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％。在第7d浇灌500mlhoagland有氮营养液。
4)制备菌液：将步骤2)中的根瘤菌株ty平板活化后转接入50mlty液体培养基，28℃、180rpm·min-1振荡培养至菌液光密度od600nm值为0.5～1，4000rpm·min-1离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成od600nm为0.5的根瘤菌液。
5)接种根瘤菌株：在幼苗生长至第15d左右时(第1片真叶出现)，用移液器将制备好的菌液加入幼苗根部，每小盆60ml，以不含根瘤菌的ty液体培养基为对照。根瘤菌接种苜蓿品种的组合包括：菌株ll2+甘农9号苜蓿、菌株wlp2+甘农9号苜蓿、菌株ll2+甘农3号苜蓿、菌株ql2+甘农3号苜蓿、菌株wlp2+清水苜蓿、菌株ll1+清水苜蓿、菌株g3l3+陇中苜蓿、菌株lp3+陇中苜蓿。每个接种处理4个小盆作为重复。接种后每隔7d在塑料面盆中浇灌hoagland无氮营养液500ml。其余时间用灭菌蒸馏水补充水分。
6)样品采集：接种45d后(植株已生长60d)，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分。每盆随机选取20株，采集苜蓿植株的毛根(包括根瘤)并混匀，用锡箔纸包裹，并在泡沫盒内迅速用液氮冷冻，–80℃冰箱保存备用。
7)总rna提取：采用总rna提取试剂盒根据trizol法提取根组织总rna。(i)向100mg毛根组织和根瘤的混合物中加入液氮，迅速研磨至粉末，加入sl475μl和β-巯基乙醇25μl，涡旋震荡混匀，12000rpm离心2min；(ii)将上清液转至过滤柱cs中，12000rpm离心2min，转移上清液至新的rnase-free离心管中；(iii)加入无水乙醇(0.4倍上清体积)，混匀后转入吸附柱cr3中，12000rpm离心15sec，弃废液；(iv)将350μl去蛋白液rw1加入吸附柱cr3中，12000rpm离心15sec，弃废液；(v)将10μldnasei储存液加入新的rnase-free离心管中，再加入rdd溶液70μl，轻柔混匀；(vi)将80μldnasei工作液加入吸附柱cr3中央，室温静置15min；(vii)将350μl去蛋白液rw1加入吸附柱cr3中，12000rpm离心15sec，弃废液；(viii)将500μl漂洗液rw加入吸附柱cr3中，12000rpm离心15sec，弃废液；(ix)重复步骤(viii)；(x)将步骤(ix)中的cr3吸附柱12000rpm离心2min，转移至新的rnase-free离心管中，将30～50μlrnase-freeddh2o悬空滴入吸附膜中部，室温静置2min，12000rpm离心1min，收集rna溶液；(xi)取适量rna进行浓度测定并进行琼脂糖电泳检测，其余保存于–80℃冰箱。
8)总rna的质量检测：采用nanodrop超微量紫外分光光度计和2％琼脂糖凝胶电泳定量检测rna条带，再利用agilent2100生物分析仪进行rna样品质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性，其余–80℃冰箱保存备用。
9)cdna文库构建及上机检测：以步骤7)、8)提取和检测的总rna样品为材料，用带有oligo(dt)的磁珠富集真核生物mrna。首先，以短片段mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cdna链；其次，利用dntps、缓冲液、dnapolymerasei和rnaseh合成第二条cdna链，通过qiaquickpcr试剂盒纯化、eb缓冲液洗脱、末端修复、加poly(a)和连接测序接头，采用琼脂糖凝胶电泳选择长度为150～200bp的片段。最后采用phusion高保真度dna聚合酶、通用pcr引物和index(x)引物进行pcr扩增，并用agilent2100生物分析仪检测扩增产物质量。建好的cdna测序文库用illuminanovaseq6000平台进行测序。
10)转录本denovo组装和基本注释：利用fastqc(v0.11.5)对测序得到的原始数据进行质控，滤去含adapter、n比例>10％以及低质量的reads，获得高质量的cleanreads；并通过碱基组成、质量值分布图和饱和度分析检测数据质量情况。使用trinity(v2.2.0)组装软件对过滤后的高质量cleanreads进行转录本denovo拼接组装，然后进行转录本聚类，取最长转录本为unigene，最后通过n50数值和序列长度来评估组装结果质量。采用blast+(v2.4.0)将转录本注释到nr(non-redundantproteinsequencesfromncbi)、cog/kog(clusteroforthologousgroupsofproteins)和kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)数据库；利用blast2go(v2.3.5)软件进行go(geneontology)注释。
11)基因差异表达分析：利用rsem软件包(v1.2.31)将全长reads直接比对到参考unigenes上，用fpkm值表示基因表达水平，对基因的表达量进行定量分析。采用edger软件(v3.14.0)进行差异基因分析，错误发现率(falsediscoverrate，fdr)≤0.05且|log2fc|>1为筛选差异基因的条件，以表达差异倍数(foldchange，fc)≥2或≤0.5表示表达上调或下调，在转录组比较组合中选取差异基因。fdr值越小，表达差异越显著。通过比对go数据库对差异基因进行功能注释和显著性富集分析；通过比对kegg数据库，对差异基因参与的细胞代谢途径及其产物功能进行系统分析。
12)专一性共生结瘤效应确定：陇中苜蓿上接种菌株组合g3l3vs.lp3的差异基因数量占苜蓿总基因组的12.2％，这2株菌与陇中苜蓿专一性强；甘农3号苜蓿上接种菌株组合ll2vs.ql2的差异基因数量占总基因组的1.7％，其中ql2仅与甘农3号苜蓿专一性高效共生，ll2与甘农3号和甘农9号均高效共生；清水苜蓿上接种菌株组合wlp2vs.ll1的差异基因数量占总基因组的2.7％，其中ll1仅与清水苜蓿专一性高效共生，wlp2与清水和甘农9号苜蓿均高效共生；甘农9号苜蓿上接种菌株组合ll2vs.wlp2的差异基因数量占总基因组的0.5％，这2株菌与甘农9号苜蓿和其它苜蓿品种均共生，专一性弱。
本发明采用转录组学方法，以4个m.sativa品种和6株s.meliloti菌为基础，直接鉴定紫花苜蓿与根瘤菌的结瘤专一性。根瘤菌接种处理对比组合间的差异基因越多，此菌株与该品种的专一性越强。转录组结果与共生效应指标分析结果完全一致，并为结瘤专一性效应提供了合理的解释。
此发明直接采用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌的结瘤专一性，是从植物品种和同一个种内根瘤菌株的角度对专一性共生效应进行的更深层次的分析，极大程度上简化了高效共生体系的发掘和专一性根瘤菌株的鉴定过程。
由于所采用的试验和分析方法简便合理，易于操作。因此本发明具有很好的实用性和可靠性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。