通过动态调控ATP促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用的制作方法

本发明属于发酵技术领域，具体地，涉及通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用。

背景技术：

谷胱甘肽（glutathione，gsh）是细胞内广泛存在的生物活性小分子物质，在生物体内发挥着重要的生理功能。gsh对于维持体内适宜的氧化还原环境起着重要作用，同时谷胱甘肽具有提高机体免疫力和抗氧化等功能，在临床医药和食品加工领域都有着广泛的用途。谷胱甘肽在细胞内以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸谷为底物，通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-gcs,ec6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(gs,ec6.3.2.3)在atp存在下催化这三种底物氨基酸合成。无论是通过哪种微生物发酵生产谷胱甘肽，atp的供应都是至关重要的。

目前关于提高atp水平来促进产物合成的研究多集中在发酵过程的控制优化方面。例如，添加柠檬酸等能量底物来提高胞内atp水平或者加入正己烷、正庚烷一类的携氧载体来促进胞内atp的合成。也有直接添加atp的方式解决底物atp的供给问题。然而atp价格昂贵，且难以通过细胞膜，因此无法通过直接添加的方式解决atp的供给问题。也有学者通过基因工程手段构建atp再生系统来提高atp的供应，如引入磷酸烯醇丙酮酸与丙酮酸激酶，磷酸肌酸与肌酸激酶，乙酰磷酸与乙酸激酶，聚磷酸(polyp)与聚磷酸激酶（ppk）。但是这些方法的调控范围有限，只能单一实现胞内atp水平的上调或者下调。

在枯草芽孢杆菌中发现的天然rna模块ydao作为核糖开关，可以通过响应胞内atp水平而调控基因的表达。当胞内atp浓度高于一定水平，ydao模块和atp分子作用形成茎环结构的rna，阻碍ydao下游基因的转录；反之，当胞内atp浓度低于一定水平，ydao模块本身可作为启动子元件开启下游基因的转录。提高胞内atp水平有利于atp依赖型产物的合成，但是atp水平过高可能会对细胞造成不良的影响，例如会阻碍细胞的生长。

大多数聚磷酸激酶只有在具有10多个磷酸盐残基的聚磷酸盐存在下才具有活性。最近从谷氨酸棒状杆菌中发现的ppk编码的聚磷酸激酶可以利用廉价的poly(3)或poly(4)作为磷酸盐供体，从adp再生atp，具有更大的工业潜力。

技术实现要素：

为了解决现有技术中单一调控胞内atp水平的问题，本发明的目的一在于提供一种通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒，目的二在于提供一种工程菌，目的三在于提供利用所述工程菌促进谷胱甘肽合成方面的应用。通过基因重组技术，在大肠杆菌中构建基于核糖开关ydao模块和聚磷酸激酶（ppk）的atp调控方法，可实现控制atp浓度在一定水平，从而利于胞内atp依赖性产物的合成。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种重组质粒，由核糖开关ydao模块、提高胞内atp水平的基因、gshf基因片段和质粒载体重组构建而成；所述提高胞内atp水平的基因连接在核糖开关ydao模块的下游。

作为对上述方案的进一步优化，所述核糖开关ydao模块来源于枯草芽孢杆菌。

作为对上述方案的进一步优化，所述提高胞内atp水平的基因为来源于谷氨酸棒状杆菌的ppk基因。

作为对上述方案的进一步优化，所述质粒载体为prsfduet-1质粒。

本方面还提供一种工程菌，是将上述的重组质粒转入谷胱甘肽产生菌中而得到的。进一步地，所述谷胱甘肽产生菌为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明还进一步提供利用所述的工程菌发酵生产谷胱甘肽的方法，将所述工程菌在lb培养基中过夜培养，然后接种到发酵培养基中发酵；当菌体生物量至od600为0.4-0.6时，加入iptg诱导，并加入终浓度为15-50mmol/l的三聚磷酸钠，继续培养至发酵结束。

所述发酵培养基为m9培养基；所述m9培养基的配方为：每1l体积中含有葡萄糖20g、na2hpo4·2h2o7.52g、kh2po43g、nacl0.5g、nh4cl0.5g、mgso4·2h2o0.25g、cacl2·2h2o0.15g、生物素1g、硫胺素1g和100×微量元素溶液10ml；

所述100×微量元素溶液的配方为：每1l体积中含有edta5g、fecl3·6h2o0.83g、zncl284mg、cucl2·2h2o13mg、cocl2·2h2o10mg、h3bo310mg和mncl2·4h2o1.6mg。

本发明另外提供所述的工程菌在通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成方面的应用。

有益效果：

1、本发明利用枯草芽孢杆菌中发现的atp核糖开关ydao模块动态调控胞内atp水平，并通过表达双功能谷胱甘肽合成酶gshf，促进谷胱甘肽生物合成。

2、本发明提出了一种基于atp核糖开关ydao模块和谷氨酸棒状杆菌来源的聚磷酸激酶的atp调控策略，以提高大肠杆菌胞内谷胱甘肽的合成。本发明设计将能提高胞内atp水平的基因(ppk)连接在核糖开关ydao模块的下游，构建基于核糖开关ydao模块和聚磷酸激酶（ppk）的atp调控方法，该方法可以响应大肠杆菌胞内atp浓度。当胞内atp水平高时，ydao下游的基因不表达或者表达较少。当胞内的atp水平降低时，ydao开启转录，胞内atp水平提高，谷胱甘肽产物合成能力提高。开发的atp调控系统可以实现一定水平下atp浓度的动态控制，在不影响生物量的前提下促进细胞内谷胱甘肽合成。此外该方法对于其他atp依赖性产物的合成也有一定的应用价值。

附图说明

图1是atp动态调控谷胱甘肽合成的原理示意图；

图2是prsfduet-ydao质粒图谱的质粒构建图谱；

图3是prsfduet-ppk质粒构建图谱；

图4是prsfduet-ydao-ppk质粒构建图谱；

图5是prsfduet-ydao-ppk-gshf质粒构建图谱；

图6是prsfduet-ydao-gfp质粒构建图谱；

图7是不同磷酸盐浓度对于菌株ayg胞内atp和荧光强度的影响图；

图8是不同磷酸盐浓度对于菌株controly胞内atp和荧光强度的影响图；

图9是atp调控系统对于工程菌和对照菌的生物量影响图；

图10是atp调控系统对于工程菌和对照菌的谷胱甘肽合成浓度影响图；

图11是atp调控系统对于工程菌和对照菌的atp浓度、atp/adp比率的影响图；

图12是atp调控系统和双功能谷胱甘肽合成酶对于工程菌和对照菌的谷胱甘肽浓度影响图。

具体实施方式

一种动态调控atp促进谷胱甘肽合成的工程菌，其构建方法按照以下的步骤进行：

(1)纯化扩增出枯草芽孢杆菌中的ydao基因片段，构建得到重组质粒prsfduet-ydao；

(2)纯化扩增出谷氨酸棒状杆菌的ppk基因，构建得到重组质粒prsfduet-ppk和prsfduet-ydao-ppk，用于胞内atp水平的动态调控；

(3)纯化扩增出嗜热链球菌中的gshf基因片段，构建得到重组质粒prsfduet-ydao-ppk-gshf，通过表达谷胱甘肽合成的双功能酶进一步促进谷胱甘肽的合成；在所述重组质粒prsfduet-ydao-ppk-gshf中，所述atp调控基因ppk连接在核糖开关ydao模块的下游，gshf基因插入到同一重组质粒中；

(4)将步骤(3)构建的重组质粒通过电转化法转入到e.colibl21(de3)感受态细胞中，最终获得阳性转化子；

(5)步骤（4）所述的阳性转化子在含有抗生素抗性培养基的筛选培养后，最终得到生产谷胱甘肽的基因工程菌，利用所述基因工程菌动态调控胞内atp浓度，并通过表达双功能谷胱甘肽合成酶gshf，促进谷胱甘肽生物合成；

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：动态调控胞内atp水平的质粒prsfduet-ydao-ppk的构建

用购买自tiangen公司的细菌基因组提取试剂盒从枯草芽孢杆菌中提出基因组dna作为模板，以引物bamhi-ydao-f5’-cgggatccgattttagcctctg（序列如seqidno：4所示）和psti-ydao-r5’-aactgcagaatcaaaaaacgtttga（序列如seqidno：5所示）为引物，扩增ydao片段，基因序列如seqidno：1所示。扩增体系(100μl)：双蒸水60.5μl，dntp8μl（200μmol/l），buffer20μl（mg2+50mmol/l），上下游引物各5μl（10umol/l），模板0.5μl，phusionhigh-fidelity聚合酶1μl。pcr扩增条件：98℃预变性30sec之后，98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10sec，30个循环。72℃延伸5min之后得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收。然后将质粒prsfduet-1和ydao片段用限制性内切酶bamhi和psti酶切，琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收，用t4连接酶连接构成质粒prsfduet-ydao(图2)。用用购买自tiangen公司的细菌基因组提取试剂盒从谷氨酸棒状杆菌提取出基因组作为模板，以引物psti-ppk-faactgcagatggtgggtaaacttcccatc（序列如seqidno：6所示）和noti-ppk-rataagaatgcggccgcctagtcaccgatctggtcgcgccc（序列如seqidno：7所示）为引物，扩增ppk基因片段，其基因序列如seqidno：2所示。扩增体系(100μl)：双蒸水60.5μl，dntp8μl（200μmol/l），buffer20μl（mg2+50mmol/l），上下游引物各5μl（10umol/l），模板0.5μl，phusionhigh-fidelity聚合酶1μl。pcr扩增条件：98℃预变性30sec之后，98℃变性10s，65℃退火20s，72℃延伸1min,30个循环。72℃延伸5min之后得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收。然后将质粒prsfduet-1，prsfduet-ydao质粒和ppk基因片段用限制性内切酶psti和noti酶切，琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收，用t4连接酶连接构成质粒prsfduet-ppk和prsfduet-ydao-ppk(图3，图4)。

实施例2：带有双功能谷胱甘肽合成酶的质粒prsfduet-ydao-ppk-gshf的构建

用购买自tiangen公司的细菌基因组提取试剂盒从嗜热链球菌中提出基因组dna作为模板，以ndei-gshf-f5’-ggaattccatatgatgacattaaaccaacttcttca（序列如seqidno：8所示）和xhoi-gshf-r5’-ccgctcgagttaagtttgaccagccactatttctg（序列如seqidno：9所示）为引物，扩增gshf片段，其基因序列如seqidno：3所示。扩增体系(100μl)：双蒸水60.5μl，dntp8μl（200μmol/l），buffer20μl（mg2+50mmol/l），上下游引物各5μl（10umol/l），模板0.5μl，phusionhigh-fidelity聚合酶1μl。pcr扩增条件：98℃预变性30sec之后，98℃变性10s，65℃退火20s，72℃延伸1min,30个循环。72℃延伸5min之后得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收。然后将质粒prsfduet-ydao-ppk和gshf基因片段用限制性内切酶ndei-和xhoi酶切，琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收，用t4连接酶连接构成质粒prsfduet-ydao-ppk-gshf(图5)。

实施例3：验证atp核糖开关ydao模块对于atp浓度响应的实验

将实验室保存的带有prsfduet-ydao-gfp(ydao模块下游连接gfp基因，图6)的质粒标为ayg，通过在培养基中调整磷酸盐浓度而改变atp浓度，以绿色荧光强度的强弱来验证atp浓度变化对于ydao下游基因表达的影响。并以prsfduet-ydao质粒的菌株作为对照菌株controly。将两株菌在补充有适当抗生素的lb培养基(200rpm，37℃)中培养过夜。将过夜lb培养物以1％(v/v)接种到新鲜m9培养基中进行发酵。菌体生物量在od600为0.4-0.6时，使用不同浓度诱导剂iptg诱导细胞，之后于30℃，200rpm发酵培养。实验在磷酸浓度正常的m9培养基中记录为normal，将1/5和1/10正常磷酸盐浓度的培养基分别记录为medium和low，且不添加磷酸盐的培养基记为control。培养6h后，测定菌株ayg和对照的细胞内atp浓度和荧光强度。我们将最高荧光强度定义为1.0。结果如图7和图8所示，细胞内atp含量随着培养基中磷酸盐浓度的降低而降低，而荧光强度则随着atp含量的降低而增加，表明来自枯草杆菌的ydao模块可以通过响应细胞内atp水平来启动大肠杆菌中后续基因的转录表达。

所述的lb培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5gg、氯化钠5g，加双蒸水至1000ml，121℃灭菌30min。为了对目的菌株进行筛选，在培养基中添加相应适量的抗生素。

所述的m9培养基为发酵培养的基本培养基：葡萄糖20g，na2hpo4·2h2o7.52g,kh2po43g,nacl0.5g,nh4cl0.5g,mgso4·2h2o0.25g,cacl2·2h2o0.15g,生物素1g,硫胺素1g，10ml100×微量元素溶液。100×微量元素溶液(每升)包括edta5g,fecl3·6h2o0.83g,zncl284mg,cucl2·2h2o13mg,cocl2·2h2o10mg,h3bo310mg,mncl2·4h2o1.6mg。

实施例4：验证工程菌功能的发酵实验

将构建的四个质粒prsfduet-ydao，prsfduet-ppk和prsfduet-ydao-ppk，prsfduet-ydao-ppk-gshf分别转入感受态细胞e.colibl21(de3)中获得菌株标记为controly，app，ayp和aypgs。所有菌株在补充有适当抗生素的lb培养基(200rpm，37℃)中第一次培养过夜。将过夜lb培养物以1％(v/v)接种到新鲜m9培养基中。菌体生物量在od600为0.4时，使用不同浓度诱导剂iptg诱导细胞，并加入三聚磷酸钠达到终浓度15-50mm。测定工程菌和对照菌的生物量、胞内atp、adp浓度和谷胱甘肽浓度如图9、图10、图11和图12所示。结果表明：ydao模块结合聚磷酸激酶ppk可以动态调控胞内atp浓度，并将细胞内atp水平维持在0.20mgl^-1od^-1左右。由于胞内atp水平的动态调控结合双功能谷胱甘肽合成酶的引入，大肠杆菌合成谷胱甘肽的能力大幅度提升。由此可见，本实施方式构建的工程菌可用于促进谷胱甘肽的合成。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

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<110>河南科技大学

<120>通过动态调控atp促进谷胱甘肽合成的重组质粒、工程菌及其应用

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