一种利尿剂个体化用药基因检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及基因检测试剂盒领域，特别涉及一种利尿剂个体化用药基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

临床用药结果表明，高血压用药的疗效和不良反应存在较大的个体差异。遗传药理学和药物基因组学的研究进展表明，除了性别、年龄、种族等原因外，药物代谢酶、转运体和靶点的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因，根据个体特征与药物治疗相关的代谢酶、转运体和靶点制定治疗方案，实现个体化用药,使药物的疗效达到最大，不良反应降到最小，具有十分重要的社会意义和经济意义。

利尿药是一类促进电解质和水从机体内排出、增加尿量、消除水肿的药物。利尿药自50年代进入临床作为基础降压药，至今仍为临床常用。nppa作为编码anp的前体，基因定位于染色体1p36-p35，编码126个氨基酸的前心房脑钠肽，而anp为利尿剂，可控制细胞外液量及电解质平衡；anp和血压调控、心机肥厚和纤维化等有关。而有研究结果显示，降低anp水平可导致盐敏感高血压，提高anp水平则可导致低血压，大量研究证明，anp及nppa与多种心脑血管疾病相关，如心力衰竭、脑卒中及高血压等。nppa(455t>c)野生型患者对利尿药的反应差，治疗作用不好基因突变的患者，对利尿药的反应敏感，治疗作用好；突变患者建议使用利尿药。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种利尿剂个体化用药基因检测试剂盒及其检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明一种利尿剂个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：

(1)nppa(455t>c)位点扩增和测序引物1对，每条引物1od，引物序列(正向引物：aagttcagaggatgggcaca，反向引物：acacaaatgcagcagagacc)；

(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液15μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)；

(3)pcr产物纯化试剂：3.2μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)；

(3)测序试剂：4.4μlbigdyemix(bigdye、5×seq)、5μledta、60μl乙醇溶液(100％)、200μl乙醇溶液(70％)、16μlhi-di。

作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融的状态下。

本发明还提供一种基于利尿剂个体化用药基因检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

(1)提取样本的基因组dna；

(2)nppa(455t>c)位点区域pcr扩增；

所述步骤(2)nppa(455t>c)位点区域pcr扩增，采用引物序列(正向引物：aagttcagaggatgggcaca，反向引物：acacaaatgcagcagagacc)；每个反应体系为总体积50μl，包含taq酶混合液25μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)、去离子水17μl、引物对(5μm)3μl、基因组dna(50ng/μl)2μl。pcr反应条件为95℃3分钟，进行35个循环的95℃30秒，56℃20秒，72℃30秒最后进行72℃5分钟；

(3)pcr产物纯化

每个反应体系总体积为5.6μl，pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)，反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；

(4)dna测序反应

每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl，反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟，放入测序仪中；

(5)结果分析

对nppa(455t>c)位点进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件chromas查阅测序检测结果，将测定的各样本序列与genbank数据库nppa基因序列(nm_006172.4)进行比较。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本产品可以通过nppa(455t>c)基因分型检测，使用关键技术为sanger测序(准确率大于99.9％)，通过该项目检测可以指导高血压患者根据个体的基因组信息实现个体化用药,使药物的疗效达到最大，不良反应降到最小。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明未检出突变：nppa(455t>c)位点示意图；

图2是本发明检出突变：nppa(455t>c)位点存在突变示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如图1-2所示，本发明提供一种利尿剂个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：

(1)nppa(455t>c)位点扩增和测序引物1对，每条引物1od，引物序列(正向引物：aagttcagaggatgg

gcaca，反向引物：acacaaatgcagcagagacc)；

(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液15μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)；

(3)pcr产物纯化试剂：3.2μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)；

(3)测序试剂：4.4μlbigdyemix(bigdye、5×seq)、5μledta、60μl乙醇溶液(100％)、200μl乙醇溶液(70％)、16μlhi-di。

试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融的状态下。

一种基于利尿剂个体化用药基因检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

(1)提取样本的基因组dna；

(2)nppa(455t>c)位点区域pcr扩增；

步骤(2)nppa(455t>c)位点区域pcr扩增，采用引物序列(正向引物：aagttcagaggatgggcaca，反向引物：acacaaatgcagcagagacc)；每个反应体系为总体积50μl，包含taq酶混合液25μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)、去离子水17μl、引物对(5μm)3μl、基因组dna(50ng/μl)2μl。pcr反应条件为95℃3分钟，进行35个循环的95℃30秒，56℃20秒，72℃30秒最后进行72℃5分钟；

(3)pcr产物纯化

每个反应体系总体积为5.6μl，pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)，反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；

(4)dna测序反应

每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl，反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟，放入测序仪中；

(5)结果分析

对nppa(455t>c)位点进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件chromas查阅测序检测结果，将测定的各样本序列与genbank数据库nppa基因序列(nm_006172.4)进行比较，nppa基因序列如下所示：

nppa基因序列：

gagacagggacagacgtaggccaagagaggggaaccagagaggaaccagaggggagagacagagcagcaagcagtggattgctccttgacgacgccagcatgagctccttctccaccaccaccgtgagcttcctccttttactggcattccagctcctaggtcagaccagagctaatcccatgtacaatgccgtgtccaacgcagacctgatggatttcaaggtagggccaggaaagcgggtgcagtctggggccagggggctttctgatgctgtgctcactcctcttgatttcctccaagtcagtgaggtttatccctttccctgtattttccttttctaaagaatttgctggaccatttggaagaaaagatgcctttagaagatgaggtcgtgcccccacaagtgctcagtgagccgaatgaagaagcgggggctgctctcagccccctccctgaggtgcctccctggaccggggaagtcagcccagcccagagagatggaggtgccctcgggcggggcccctgggactcctctgatcgatctgccctcctaaaaagcaagctgagggcgctgctcactgcccctcggagcctgcggagatccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaacagcttccgggtaagaggaactggggatggaaatgggatgggatggacactactgggagacaccttcagcaggaaagggaccaatgcagaagctcattccctctcaagtttctgccccaacacccagagtgccccatgggtgtcaggacatgccatctattgtccttagctagtctgctgagaaaatgcttaaaaaaaaaaggggggggggctgggcacagtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcaggcggatcatgaggtcaagagatcaagactatcctggccaacatggtgaaaccccagctctactaaaaatacaaaaattagctgggtgtggtggcgggcacctgtactctcagctacttgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggcagaggttgcagtgagcagagatcacgccactgcagtccagcctaggtgatagagcgagactgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaggccaggcacggtggctcacgcctgtaatcccagcgctttgggaggccaaggcgggtggatcacgaggtcaggagatggagaccatcctggctaacacggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaaattagccaggcgtggtggcaggcgcctgtaagtcctagctactccggaggctgaggcaggagaatggcgtgaacccgggaggcggagcttgcagtgagcagagatggcaccactgcactccagcctgggcgacagagcaagactccgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcaactgccactagcactgggaaattaaaatattcatagagccaagttatctttgcatggctgattagcagttcatattcctccccagaattgcaagatcctgaagggcttaagtgaaatttactctgatgagtaacttgcttatcaattcatgaagctcagagggtcatcaggctggggtgggggccggtgggaagcaggtggtcagtaatcaagttcagaggatgggcacactcatacatgaagctgacttttccaggacagccaggtcaccaagccagatatgtctgtgttctctttgcagtactgaagataacagccagggaggacaagcagggctgggcctagggacagactgcaagaggctcctgtcccctggggtctctgctgcatttgtgtcatcttgttgccatggagttgtgatcatcccatctaagctgcagcttcctgtcaacacttctcacatcttatgctaactgtagataaagtggtttgatggtgacttcctcgcctctcccaccccatgcattaaattttaaggtagaacctcacctgttactgaaagtggtttgaaagtgaataaacttcagcaccatggacagaagacaaa。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本产品可以通过nppa(455t>c)基因分型检测，使用关键技术为sanger测序(准确率大于99.9％)，通过该项目检测可以指导高血压患者根据个体的基因组信息实现个体化用药,使药物的疗效达到最大，不良反应降到最小。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。