一种雷帕霉素的纯化方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种雷帕霉素的纯化方法。

背景技术：

雷帕霉素(rapamycin，rpm)又称西罗莫司(sirolimus)，是一种新型大环内酯类强效免疫抑制剂，1999年美国fda批准作为新型临床抗肾移植排斥反应药物，2001年获欧洲药物管理局(ema)批准上市，2010年中国食品药品监督管理局(cfda)批准上市。雷帕霉素相比目前临床使用的免疫抑制药物环孢素a和他克莫司(fk506)，具有口服剂量更小(每次仅需2～3mg)、抗排异作用更强，且副作用更少的优势，是目前市售最好的免疫抑制剂。另外，《cell》、《blood》、《gut》等权威杂志研究表明雷帕霉素还具有治疗糖尿病、肥胖症、帕金森、胰腺癌等疑难杂症的新潜能，预示了雷帕霉素未来的应用前景十分广阔。

雷帕霉素主要通过吸水链霉菌或游动链霉菌微生物发酵法生产，目前发酵水平还比较低，大都小于1g/l。而且雷帕霉素亲脂性,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和氯仿等有机溶剂，极微溶于水，给雷帕霉素下游提取纯化带来极大困难。常规雷帕霉素提取大致流程：发酵结束后收集菌丝体，有机溶剂浸提，有机溶剂萃取、活性炭脱色、过滤除活性炭、滤液降压浓缩、硅胶柱层析、冷却析晶技术得到雷帕霉素。该方法不仅工艺较为繁琐，而且在工业操作上存在一定困难。如链霉菌经长时间工业补料发酵，下罐时菌丝体含量较高、较粘稠，不易过滤，需加水稀释；雷帕霉素主要位于菌丝体内，但生产发现发酵液也存在可观雷帕霉素，直接废弃较浪费；常规采用有机溶剂浸提、萃取等，不同类型有机溶剂用量大，对人体对环境均存在一定危害。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种雷帕霉素的纯化方法，采用活性炭吸附/解吸附-高效逆流色谱分离雷帕霉素的方式，不仅工艺操作性强，而且可以有效提高雷帕霉素的收率。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种雷帕霉素的纯化方法，所述纯化方法包括：

在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；

将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物；

用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；

用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。

在一个实施例中，所述第一温度为35-42℃。

在一个实施例中，所述第一溶剂为乙醇或丙酮；

和/或，所述第二溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种；

和/或，所述第三溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。

在一个实施例中，所述在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液步骤中，抽提时间为2-4小时。

在一个实施例中，所述雷帕霉素发酵液体积与所述第一有机溶剂的体积比为1:1-1:2。

在一个实施例中，所述活性炭与所述第二有机溶剂的体积比为1:4.5-1:5.5；

和/或，所述活性炭与所述第三有机溶剂的体积比为1:1.5-1:2.5。

在一个实施例中，所述将活性炭加入滤液中，得到第一中间产物步骤包括：将活性炭加入滤液中，搅拌吸附后，过过滤器得到第一中间产物，所述第一中间产物为活性炭滤饼。

在一个实施例中，所述将所述滤液过活性炭，得到第一中间产物步骤中，所述活性炭的质量与所述滤液的体积比为1:50-1:100g/ml。

在一个实施例中，所述将所述滤液过活性炭，得到第一中间产物步骤中，搅拌吸附的时间为1-5小时。

在一个实施例中，所述用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液步骤包括：用第三有机溶剂对所述第二中间产物解吸附循环洗涤3-5次，每次1-2小时，重复解吸附步骤2-5次，将洗脱液合并后，浓缩洗脱液，得到浓缩液。

本发明提供的雷帕霉素的纯化方法包括：在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；将所述滤液过活性炭柱，得到第一中间产物；用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。此方法通过活性炭吸附/解吸附-高效逆流色谱分离雷帕霉素，具有工艺操作性强，产品纯度高，收率高，适合在工业规模上生产等优点。

附图说明

图1为本发明中实施例1中纯化雷帕霉素和雷帕霉素标准品的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种雷帕霉素的纯化方法，包括：

步骤s11，在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；

步骤s12，将所述滤液过活性炭柱，得到第一中间产物；

步骤s13，用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质，得到第二中间产物；

步骤s14，用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；

步骤s15，将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。

进一步地，在步骤s11中，所述第一温度为35-42℃，例如可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，优选为40℃。当温度过低时，溶出效果不好，当温度过高时，有机溶剂会挥发。

雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比为1:1-1:2，例如可以为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:2等。当雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比过大时，雷帕霉素的溶解率不高，当雷帕霉素发酵液体积与第一有机溶剂的体积比过小时，会导致有机溶剂的体积过大，有机溶剂过大会增加后续处理问题，导致环境污染等问题。

抽提时间为2-4小时，例如可以为2、2.5、3、3.5、4等，优选为2小时。当抽提时间过小时，溶出效果不好，当抽提时间过大时，会增大能耗，从而会增大抽提的成本。

第一溶剂为乙醇或丙酮，优选为乙醇，当乙醇作溶剂时，得到的纯化雷帕霉素的纯度最高。

进一步地，步骤s12包括：将活性炭加入滤液中，搅拌吸附后，过过滤器得到第一中间产物，所述第一中间产物为活性炭滤饼。

活性炭的质量与滤液的体积比为1:50-1:100g/ml，例如可以为1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100。当比值活性炭的质量与滤液的体积比过大时，会增加后续有机溶剂的用量，当比值活性炭的质量与滤液的体积比过小时，吸附不完全。

搅拌吸附的时间为1-5小时，例如可以为1、1.5、2、2.5、3、4、5，优选为1小时。当吸附时间过小时，吸附不完全，吸附1小时吸附值大于95％，随着时间的增加吸附量几乎不增加。

进一步地，在步骤s13中，第二溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，优选为乙腈或无水甲醇。当乙腈或无水甲醇作溶剂时，得到的纯化雷帕霉素的纯度更高。第二溶剂的体积与水的体积百分比小于20％。

活性炭体积与第二有机溶剂的体积比为1:4.5-1:5.5，例如可以为1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.5，优选为1:5。当活性炭体积与第二有机溶剂的体积比过小时，会导致有机溶剂的体积过大，有机溶剂过大会增加后续处理问题，导致环境污染等问题；当活性炭体积与第二有机溶剂的体积比过大时，去除吸附杂质和色素的效果不好。

进一步地，在步骤s14中，第三溶剂包括乙酸乙酯、无水甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种，优选为乙腈或无水甲醇。当乙腈或无水甲醇作溶剂时，得到的纯化雷帕霉素的纯度更高。

活性炭体积与第二有机溶剂的体积比为1:1.5-1:2.5，例如可以为1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5，优选为1:2。当活性炭体积与第二有机溶剂的体积比过小时，会导致有机溶剂的体积过大，有机溶剂过大会增加后续处理问题，导致环境污染等问题；当活性炭体积与第二有机溶剂的体积比过大时，得到的纯化雷帕霉素的纯度不高。

用第三有机溶剂对第二中间产物循环洗脱活性炭柱解吸附循环洗涤3-5次，每次1-2小时，重复解吸附步骤2-5次，将洗涤液合并后，再浓缩。

进一步地，在步骤s15中，将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化的雷帕霉素。

本发明提供的雷帕霉素的纯化方法包括：在第一温度下，用第一有机溶剂对雷帕霉素发酵液进行抽提后，过滤得到滤液；将所述滤液过活性炭柱，得到第一中间产物；用第二有机溶剂水溶液洗脱所述第一中间产物的吸附杂质和色素，得到第二中间产物；用第三有机溶剂循环洗脱所述第二中间产物，浓缩洗脱液，得到浓缩液；将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，得到纯化的雷帕霉素。此方法通过活性炭吸附/解吸附-高效逆流色谱分离雷帕霉素，具有工艺操作性强，产品纯度高，收率高，适合在工业规模上生产等优点。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考，对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

步骤s1:在40℃下，用乙醇(1500l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:75(活性炭的质量为25kg)。

步骤s3:用乙腈水溶液(300l，乙腈与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙腈(120l)对上述中间产物解吸附循环洗涤3次，每次1h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(720l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.68％。

雷帕霉素标准品：西罗莫司溶液，生产厂家为supelco，浓度为1.0mg/ml。

用高效液相色谱法(hplc)检测上述步骤s5中得到的纯化雷帕霉素和雷帕霉素标准品的纯度。hplc条件为：安捷伦高效液相色谱仪a1200，色谱柱：hypersilbdsc18柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长：278nm；流动相：85％甲醇；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；检测器灵敏度：0.02anfs；柱温：45℃。其hplc结果如附图一所示。

纯度计算：以雷帕霉素溶液(1mg/ml)hplc图主峰面积为对照，纯度＝(纯化雷帕霉素主峰面积/雷帕霉素标准品hplc主峰面积)×1.0mg/ml×纯化雷帕霉素溶液体积/纯化雷帕霉素重量/(1-水分含量)。由计算结果可知上述步骤s5中得到的纯化雷帕霉素的纯度为95.68％。

实施例2

步骤s1:在35℃下，用乙醇(1000l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为28kg)。

步骤s3:用乙腈水溶液(320l，乙腈与水的百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙腈(140l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次2h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(1400l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.22％。

实施例3

步骤s1:在42℃下，用乙醇(1700l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:100(活性炭的质量为20kg)。

步骤s3:用乙腈水溶液(275l，乙腈与水的百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙腈(125l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次3h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(1250l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.33％。

实施例4

步骤s1:在35℃下，用乙醇(2000l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为48kg)。

步骤s3:用乙腈水溶液(550l，乙腈与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙腈(250l)对上述中间产物解吸附循环洗涤4次，每次4h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(2000l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.17％。

实施例5

步骤s1:在35℃下，用乙醇(1900l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为46kg)。

步骤s3:用乙酸乙酯水溶液(600l，乙酸乙酯与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙酸乙酯(250l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次5h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(2500l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.48％。

实施例6

步骤s1:在42℃下，用丙酮(1800l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:100(活性炭的质量为22kg)。

步骤s3:用乙酸乙酯水溶液(250l，乙酸乙酯与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙酸乙酯(100l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次3h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(1000l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.11％。

实施例7

步骤s1:在36℃下，用丙酮(2000l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为48kg)。

步骤s3:用无水甲醇水溶液(600l，无水甲醇与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用无水甲醇(250l)对上述中间产物解吸附循环洗涤4次，每次1h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(2000l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.54％。

实施例8

步骤s1:在38℃下，用丙酮(1900l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为46kg)。

步骤s3:用丙酮水溶液(580l，丙酮与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用丙酮(240l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次5h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(2400l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.35％。

实施例9

步骤s1:在42℃下，用丙酮(1700l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:100(活性炭的质量为20kg)。

步骤s3:用乙酸乙酯水溶液(260l，乙酸乙酯与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙酸乙酯(100l)对上述中间产物解吸附循环洗涤5次，每次3h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(1000l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.41％。

实施例10

步骤s1:在41℃下，用丙酮(2000l)对雷帕霉素发酵液(1000l，含量1.2g/l)进行抽提，抽提2h后，过滤得到滤液。

步骤s2:将活性炭加入上述步骤s1得到的滤液中，搅拌吸附1h后，过过滤器得到活性炭滤饼。其中活性炭的质量与滤液的体积比为1:50(活性炭的质量为48kg)。

步骤s3:用乙腈水溶液(620l，乙腈与水的体积百分比小于20％)洗脱上述活性炭滤饼所吸附的杂质，得到中间产物。

步骤s4:在60℃下，用乙腈(250l)对上述中间产物解吸附循环洗涤3次，每次4h，重复解吸附步骤2次，将洗涤液合并(1500l)，浓缩至原始体积的1/10，得到浓缩液。

步骤s5:将所述浓缩液经高效逆流色谱分离后，减压浓缩干燥可制备得到纯化雷帕霉素。纯化雷帕霉素的纯度为95.56％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。