一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR试剂及方法与流程

一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒sars-cov-2的荧光rt-pcr试剂及方法
技术领域
[0001]
本发明涉及病原微生物检测技术，具体涉及甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒sars-cov-2的核酸检测。


背景技术：

[0002]
呼吸道感染是人类最常见的一类疾病，是引起人群发病和死亡的最主要原因之一。研究表明，呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的最常见的病原体。呼吸道病毒包括流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒等。呼吸道病毒感染引起的临床表现都较为相似，主要有鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎、气管炎、支气管炎、肺炎、咳嗽、呼吸困难、发烧、乏力等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。
[0003]
流感病毒是引起流行性感冒的病原体。流感病毒属正粘病毒科，分为甲型、乙型、丙型和2016年首次发现的丁型。流感病毒的基因组由七或八条负链rna 节段构成，每条rna编码一或两个蛋白。其中甲型流感病毒根据病毒颗粒外膜血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白抗原性的不同，可分为16个h亚型(h1-h16) 和9个n亚型(n1-n9)，由于编码ha和na的核苷酸序列容易发生突变，令ha 和na的抗原表位发生改变，致使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模的流行。乙型流感病毒主要分成victoria系与yamagata系，抗原变异较小，可引起流感的局部爆发。丙型极少引起流行，丁型暂未见流行报道。在医疗卫生领域，对甲型和乙型流感病毒的诊断和监测最为重要。
[0004]
冠状病毒是另一大类重要的呼吸道病毒。冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科，可分为α、β、γ、δ四个属，基因组均由线性单股正链的rna组成。目前已发现7种可感染人类的冠状病毒，即α属的hcov-229e和hcov-nl63，以及β属的hcov-oc43、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov和sars-cov-2。其中 sars-cov-2是引发当前新型冠状病毒肺炎(covid-19)疫情的病原体，与蝙蝠类sars冠状病毒(bat sars-like coronavirus)和sars-cov有最接近的亲缘关系。covid-19能引起和流行性感冒相似的肺炎、咳嗽、发烧、乏力等症状，所以在临床诊断和疫情防控上，区别sars-cov-2和流感病毒具有重要意义。
[0005]
荧光rt-pcr技术以特定的呼吸道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的呼吸道病毒核酸进行体外定性检测。荧光rt-pcr因其准确、灵敏、快速等特点，已被越来越多地应用于临床上辅助诊断呼吸道病毒感染相关疾病，是目前covid-19主要确诊方法。但是，常规荧光rt-pcr检测试剂均为液体试剂，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。特别是在疫情期间交通运输受阻，冷链运输条件难以保障，长途运输时试剂失效的风险及冷链管理成本大大增加，不能适应国际长途运输及冷链条件较差的基层检测机构的应用。
[0006]
此外，由于全球疫情爆发，不同地区分别进入冬季流行性感冒季节，由于流感与covid-19的早期症状相似，给疫情控制带来更大的挑战。市场急需一种能准确检测和区分
流感病毒及冠状病毒sars-cov-2的荧光rt-pcr检测试剂。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是：提供一种可准确检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒sars-cov-2，且无需冷链的多重荧光rt-pcr检测试剂及方法。
[0008]
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
[0009]
1.引物、探针的设计
[0010]
本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光 rt-pcr检测试剂所用的引物探针是基于公众基因序列数据库最新的甲型流感病毒、乙型流感病毒和sars-cov-2的核酸信息设计、筛选而得出。优选地，试剂中可添加人rnase p的特异引物探针，作为检测的内标。引物探针的序列如下：
[0011]
检测甲型流感病毒的特异性正向引物的序列为5
’-
catggartggctaaagacaag acc-3’(即seq id no.1)，反向引物的序列为5
’-
cattttggacaaagcgtctacg
ꢀ-3’
(即seq id no.2)，探针的序列为5
’-
cagtcctcgctcactgggcacg-3’(即 seq id no.3)。该引物、探针的序列在已知甲型流感病毒的核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。
[0012]
检测乙型流感病毒的两条特异正向引物的序列为5
’-
ttcgagcgtcttaatgaa ggaca-3’(即seq id no.4)和5
’-
cgagcgtctcaatgaaggaca-3’(即seq idno.5)(两条正向引物是针对该位置的单核苷酸多态性而设计，可按一定比例混合后使用)，反向引物的序列为5
’-
tggtgataatcggtgctcttgac-3’(即seq id no.6)，探针的序列为5
’-
caaagccaattcgagcagctgaaactg-3’(即seq id no. 7)。该引物、探针的序列在已知乙型流感病毒核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。
[0013]
检测冠状病毒sars-cov-2的特异正向引物的序列为5
’-
tgcagtcataacaaga gaagtgggt-3’(即seq id no.8)，反向引物的序列为5
’-
caaaaagtcaccatta gttgtgcg-3’(即seq id no.9)，探针的序列为5
’-
ttgtcgtgcctggtttgcctg g-3’(即seq id no.10)。所述的引物、探针的核酸序列在已知sars-cov-2 核酸序列中高度保守，且对最近缘的bat sars-like coronavirus和sars-cov 的核酸序列具有排他性。
[0014]
内标人rnase p的特异正向引物的序列为5
’-
ctgcgagcgggttctgac-3’(即 seq id no.11)，反向引物的序列为5
’-
aacgatatgattgatagcaacaactga-3’(即 seq id no.12)，探针的序列为5
’-
aaggctctgcgcggacttgtgga-3’(即seq idno.13)。该引物、探针的序列在已知人rnase p的核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。
[0015]
上述的检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒sars-cov-2及人rnasep探针的5’端用荧光报告基团修饰，3’端用荧光淬灭基团修饰。三种病毒及人 rnase p的探针的荧光报告基团分别从fam、joe、hex、vic、tet、rox和cy5 中选择不同的一种，荧光淬灭基团分别从bhq1、bhq2、bhq3、tamra和eclipse 中的选择任意一种。甲型流感病毒探针的荧光报告基团优选fam，荧光淬灭基团优选bhq1；乙型流感病毒探针的荧光报告基团优选joe，荧光淬灭基团优选bhq2；冠状病毒sars-cov-2探针的荧光报告基团优选rox，荧光淬灭基团优选bhq2；人rnase p探针的荧光报告基团优选cy5，荧光淬灭基团优选bhq2。
[0016]
2.反应体系的建立
[0017]
本发明的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr 检测
试剂的反应体积为25μl，试剂包含了对甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2的荧光rt-pcr检测所需的除样本核酸外的所有反应组分(见表1)，加水和待测样本核酸至25μl的反应体积即可上机检测。
[0018]
表1.甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂成分
[0019][0020][0021]
3.试剂的冻干
[0022]
本发明通过真空冷冻干燥技术将甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂制成常温下稳定的冻干型试剂，从而避免了常规液体荧光pcr检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。
[0023]
本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂是由表1的成分冻干而成，可将试剂冻干在容器中，优选地，可按每管1份试剂冻干在可直接上机的pcr管或多连管中。冻干所得的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂为白色颗粒，可在遮光、防潮条件下常温保存12个月。单份试剂所含干物质的体积约为2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测样本核酸即可配成25μl 的反应体系。作为优选，所加的水和样本核酸的体积分别为18μl和5μl。作为另一优选，在样本核酸提取的最后洗脱步骤中，适当增加洗脱液的量(如100 μl)即可得到合适浓度的样本核酸，该样本核酸可直接取23μl加至单份冻干试剂中。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡使试剂溶解，短暂离心后即可上机检测。
[0024]
4.反应程序及结果判定
[0025]
本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光 rt-pcr
检测试剂的反应程序按表2设置，荧光信号根据各检测目标的探针的荧光报告基团设置。
[0026]
表2.甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂的反应程序
[0027][0028]
反应后，阴性对照品(无核酸酶水)的ct≥40或无ct，阳性对照中甲型流感病毒、乙型流感病毒和sars-cov-2的ct≤35且样本中rnase p内标(试剂中含rnase p内对照时)的ct＜40，则检测有效。否则结果无效，须排除错误因素后重检。若检测有效，则甲型流感病毒、乙型流感病毒和sars-cov-2的检测结果分别根据以下条件进行判定：
[0029]
a)检测样品ct≤35，可报告为该病原体阳性；
[0030]
b)检测样品35＜ct＜40，报告为该病原体疑似阳性，需重复实验或通过独立方法进行确定。
[0031]
c)检测样品ct≥40或无ct，则报告为该病原体阴性。
[0032]
本发明的有益效果：
[0033]
本发明的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光 rt-pcr检测试剂所用的引物、探针序列是基于最新的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2核酸序列信息设计、筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性并区分甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2。另外，本发明运用真空冷冻干燥技术将甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂制成无需冷链的冻干型试剂，避免了常规液体荧光pcr检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，特别适合应长途运输和冷链条件较差的地区使用。
附图说明
[0034]
图1显示本发明所述的甲型流感病毒的检测目标序列及特异性引物和探针的位置。
[0035]
图2显示本发明所述的乙型流感病毒的检测目标序列及特异性引物和探针的位置。
[0036]
图3显示本发明所述的冠状病毒sars-cov-2的检测目标序列及特异性引物和探针的位置。
[0037]
图4显示本发明所述的人rnase p的检测目标序列及特异性引物和探针的位置。
[0038]
图5显示冻干于pcr八连管中的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂的形态。
[0039]
图6显示本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2 冻干型荧光rt-pcr检测试剂对甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars-cov-2和 rnase p核酸阳性参考品的检测结果及重复性。
[0040]
图7显示本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2 冻干
型荧光rt-pcr检测试剂对甲型流感病毒核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
[0041]
图8显示本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2 冻干型荧光rt-pcr检测试剂对乙型流感病毒核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
[0042]
图9显示本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2 冻干型荧光rt-pcr检测试剂对冠状病毒sars-cov-2核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
[0043]
图10显示本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂对人rnase p核酸阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。
具体实施方式
[0044]
以下实施例仅为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
[0045]
实施例1：本实施例提供一种用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒sars-cov-2和人rnase p核酸的荧光rt-pcr引物及探针的设计方案。
[0046]
本发明通过分析公众基因序列数据库中的甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒sars-cov-2的基因组信息及人rnase p核酸序列信息，选取了图1、2、 3、4所示的核酸序列分别作为甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒sars-cov-2和人rnase p的检测目标序列。利用primer express v3.0软件设计出以下用于扩增目标序列的引物和用于检测目标序列的探针序列：
[0047]
甲型流感病毒的特异性正向引物的序列为seq id no.1，tm＝59.0℃,反向引物的序列为seq id no.2，tm＝58.4℃,探针的序列为seq id no.3，tm＝68.2℃。探针的5’端用荧光报告基团fam修饰，3’端用荧光淬灭基团bhq1修饰。扩增子长度为122bp,该序列通过blast检查确定和其它物种的核酸序列不存在相似性，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知甲型流感病毒病毒株中高度保守，有利于防止漏检。
[0048]
乙型流感病毒的两条特异性正向引物的序列为seq id no.4(tm＝59.8℃) 和seq id no.5(tm＝60.0℃)，反向引物的序列为seq id no.6，tm＝60.0℃，探针的序列为seq id no.7，tm＝68.3℃。探针的5’端用荧光报告基团joe修饰， 3’端用荧光淬灭基团bhq2修饰。扩增子长度为99bp或97bp，该序列通过blast检查确定和其它物种的核酸序列不存在相似性，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知乙型流感病毒病毒株中高度保守，有利于防止漏检。
[0049]
sars-cov-2的特异正向引物的序列为seq id no.8，tm＝60.0℃，反向引物的序列为seq id no.9，tm＝59.6℃，探针的序列为seq id no.10，tm＝68.0℃。探针的5’端用荧光报告基团rox修饰，3’端用荧光淬灭基团bhq2修饰。扩增子长度为82bp,该序列通过blast检查确定和同源性最高的bat sars-likecoronavirus及sars-cov的序列具有足够的差异，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知sars-cov-2毒株中高度保守，有利于防止漏检。
[0050]
人rnase p的特异正向引物的序列为seq id no.11，tm＝59.1℃，反向引物的序列为seq id no.12，tm＝59.0℃，探针的序列为seq id no.13，tm＝69.8℃。探针的5’端用荧光报告基团cy5修饰，3’端用荧光淬灭基团bhq2修饰。扩增子长度为93bp,该序列通过blast检查确定和其它物种的核酸序列不存在相似性，即具有良好特异性，有利于防止错检。引物和探针序列在已知人rnase p 序列中高度保守，有利于防止漏检。
[0051]
上述甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒sars-cov-2及rnase p内标的正向引物、反向引物和探针的gc含量均在合理范围内；引物之间的tm差别微小，有利于引物的同时退火；探针的tm比引物高8℃以上，差别足够大，有利于探针早于引物完成退火。引物和探针的自身结构均维持较好，不会形成稳定的 self dimer、pair dimer和hair pin等降低反应效率的二级结构。较短的扩增子也有利于提高pcr反应效率。
[0052]
上述的正向引物、反向引物、探针由华大基因合成，用te缓冲液配成100um 的保存液和10um的工作液于-20℃保存。
[0053]
实施例2：本实施例演示通过真空冷冻干燥技术将本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2荧光rt-pcr检测试剂制成冻干型试剂。
[0054]
按表1中所述的成分及含量配制甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2荧光rt-pcr液体检测试剂，按1份/管分装于200μl pcr八连管中后进行真空冷冻干燥，得到的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂为白色颗粒(图5)。向一份试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡10s，试剂即完全溶解，用移液枪测得体积为25 μl，可知试剂复溶前体积相当于2μl。
[0055]
为防止试剂受潮和曝光，甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒 sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。
[0056]
实施例3：本实施例演示用本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂对甲型流感病毒、乙型流感病毒、 sars-cov-2和人rnase p核酸阳性参考品的检测效果。
[0057]
对甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars-cov-2及人rnase p rna阳性参考品混合液进行10倍梯度稀释，每个浓度取5μl和18μl无核酸酶水混合，然后加到1份按实施例2制备的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2 冻干型荧光rt-pcr检测试剂中；23μl无核酸酶水作为阴性对照。得到体积为 25μl的反应混合液，慢速震荡溶解、离心后在荧光pcr仪上机检测，反应程序按表2设置。每个处理做3个重复。
[0058]
检测结果如图6所示，本发明所述的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂对不低于10个拷贝的甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars-cov-2及人rnase p核酸阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间ct的差异系数(cv)＜5％，阴性对照品没有扩增信号。模板浓度的常用对数及其ct之间呈良好的线性关系(对甲型流感病毒、乙型流感病毒、 sars-cov-2及人rnase p的相关系数分别为-0.999、-0.999、-0.998和-0.996)，甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars-cov-2、人rnase p核酸的扩增效率分别为 98.27％、101.76％、93.65％和93.44％(图7、8、9、10)。
[0059]
可见，本发明的甲型流感病毒、乙型流感病毒和冠状病毒sars-cov-2冻干型荧光rt-pcr检测试剂对甲型流感病毒、乙型流感病毒、sars-cov-2和人rnase p核酸的检测表现
良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。