一种提高酱油风味物质含量的方法

本发明涉及一种提高酱油风味物质含量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

酱油的主要成分包括游离氨基酸、多肽、有机酸和挥发性风味物质，其中游离氨基酸和挥发性风味物质影响酱油的口感和风味，是影响酱油品质的关键物质。挥发性风味物质的种类和含量对酱油风味有着重要的影响，而酱油独特的风味来自于微生物群落的演替和代谢调节。通过总结酱油香气物质相关的研究报道，共鉴定整理出1038种挥发性化合物。这些化合物主要分为两大类：芳香族化合物和脂肪族化合物，进一步细分包括醇类、酸类、酯类、酚类、醛类、酮类、呋喃类和吡嗪类等。

目前主要从两个方面提高酱油的风味物质：1、改进发酵工艺。酱油风味物质受发酵因素和发酵工艺的影响，其中发酵温度、发酵时间、碳氮比、发酵力、糖化力等多因素的调控有可能有效提高风味物质含量；此外，发酵过程的温度、ph、氧气含量等发酵条件也存在影响。其弊端是由影响因素过多导致的工作量大，耗时耗力，效率低；2、微生物手段。筛选增香的微生物，是现在提高风味物质含量最主要的手段，多菌株发酵，提高酶的多样性及活性，能够较好的提高酱油的风味物质，但是菌株筛选进程缓慢，是影响酱油品质提升的原因。因此，强化酱油发酵过程中功能微生物是当前最安全有效的方法。

酱醪是酱油发酵过程重要功能微生物栖息的主要环境之一，酱醪细菌代谢产生的游离氨基酸和有机酸是酱油主体香气hemf与4-eg的主要前体，对酱油品质和风味的形成有重要影响。在酱油发酵高盐环境的不断驯化以及菌群动态更替过程中，适应酱醪环境的功能微生物菌群逐渐被富集，可以提高酱油发酵过程中风味物质生成。因此，在高盐稀态酱醪中强化功能微生物菌群对于推动提高酱油发酵过程中风味物质含量的应用具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能提高酱油风味物质含量的方法。

本发明第一个目的是提供一株类肠膜魏斯氏菌(weissellaparamesenteroides)lcw-28，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020778。

本发明第二个目的是提供一种所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28的培养方法，所述方法是将类肠膜魏斯氏菌lcw-28接种至mrs培养基并在37℃静置培养。

本发明第三个目的是提供一种发酵剂，所述发酵剂含有类肠膜魏斯氏菌lcw-28。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为：取200～600μl的类肠膜魏斯氏菌lcw-28接种于10～30mlmrs液体培养基中，37℃下活化2至3代，待类肠膜魏斯氏菌lcw-28达到1.0×10⁷cfu/ml以上活菌数时，6000～10000rpm下离心15min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于1.0×10⁷cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为ph值为6～7的0.1～0.3m磷酸盐缓冲液和/或0.5～1％的生理盐水和/或双蒸水，冷冻保护剂为10～20％的甘油和/或8～12％的海藻糖。

本发明第四个目的是提供一种提高酱油风味物质含量的方法，所述方法是在酱油发酵过程中添加所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28或所述发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28或发酵剂在发酵体系中的终浓度为1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28在含18％的酱醪环境中的浓度至少为1.0×10⁷cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，酱油发酵过程中还添加了酵母。

在本发明的一种实施方式中，酱油发酵过程中所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28或发酵剂与所述酵母同时添加。

在本发明的一种实施方式中，酱油发酵过程中所述酵母与所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28或所述发酵剂的添加数量比为1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母为鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)zq-01。

本发明第五个目的是提供所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28或所述发酵剂或所述提高风味物质含量的方法在制备酱油中的应用。

有益效果：

本发明通过对酱醪微生物分离纯化，得到一株能显著提高酱油发酵过程中风味物质生成的菌株类肠膜魏斯氏菌lcw-28。该菌株与菌株鲁氏接合酵母zq-01共同强化，能够很好地提高体系中生成的风味物质含量，可使风味物质含量与不添加菌株的control组相比提高2.1倍。同时，与不添加菌株的control组相比强化两菌有机酸总含量提高了72.76％，游离氨基酸总含量提高了33.15％。在发酵第40天时两菌强化组氨基态氮较不添加菌株的control组提高了97.4％。因此，类肠膜魏斯氏菌lcw-28是一株适用于酱油发酵生产环境并能显著提高发酵过程中风味物质含量的菌株，通过调节该菌株的添加量能够很好地将酱油中的风味物质含量控制在一个合适的范围之内，这对于在酱油发酵生产中提高风味物质具有重要意义。

生物材料保藏

本发明所提供的类肠膜魏斯氏菌，分类命名为weissellaparamesenteroideslcw-28，已于2020年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2020778，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为高盐稀态酱油发酵过程(a)类肠膜魏斯氏菌和(b)鲁氏接合酵母菌数量的动态变化。

图2为单独强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28，单独强化鲁氏接合酵母zq-01，共同强化两菌，理化指标的变化(a为还原糖变化，b为ph的变化，c为总酸的变化，d为氨基态氮的变化)。

图3为单独强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28，单独强化鲁氏接合酵母zq-01，共同强化两菌，有机酸含量的变化。

具体实施方式

鲁氏接合酵母zq-01：记载于张继冉.酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[d].江南大学,2016。

mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉浸粉8g/l，酵母浸粉4g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.04g/l，吐温801g/l。

孟加拉红培养基：蛋白胨5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，琼脂20g/l，1/3000孟加拉红溶液100ml/l。

ypd培养基：酵母提取物10g/l,蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。

实施例1：菌株的筛选

用含万古霉素(0.2g·l^-1)和那他霉素(0.1g·l^-1)的mrs培养基从酱醪中分离和筛选魏斯氏菌。选取发酵第5、15、25天的酱醪样品，取15g酱醪置于烧杯中，加入135ml无菌生理盐水并加入适量的玻璃珠，100r·min-¹振荡5min，室温静止5min后取1ml菌悬液，将菌液梯度稀释涂布于含万古霉素(0.2g·l^-1)和那他霉素(0.1g·l^-1)的mrs培养基，37℃倒置培养1-3d。从平板上挑选单菌落的接种于50ml的含万古霉素(0.2g·l^-1)和那他霉素(0.1g·l^-1)的mrs液体培养基，37℃、静置培养24h，8000r/min，离心收集菌体。

使用商品化基因提取试剂盒提取上述所菌株的基因组，并以此为模板利用16srrna通用引物及recn基因特异性引物(表1)分别扩增菌株的16srrna基因序列和recn基因序列，扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序，测序结果与ncbi数据库中序列进行比对分析。

表1pcr引物

实施例2：利用类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01制备酱油

(1)菌株培养：

类肠膜魏斯氏菌lcw-28的培养：从微生物活化平板上挑取类肠膜魏斯氏菌单菌落接种到液体mrs培养基中，37℃静置培养24h，按1％(v/v)比例接种至新鲜mrs培养基，培养至od600达到3.0。

鲁氏接合酵母zq-01的培养：从微生物活化平板上分别挑取酵母单菌落接种到液体ypd培养基中，37℃、220r·min^-1培养30h，按1％(v/v)比例接种至新鲜ypd培养基，培养至od600达到4.0。

(2)高盐稀态酱油发酵工艺：

制曲工艺：将豆粕用1.2倍的水浸泡2h，在121℃下灭菌15min，冷却至室温。将酱油曲精(原料总重的1.5‰(w/w))与适量炒熟的小麦颗粒混合均匀，然后再和豆粕、小麦颗粒(w/w＝6:4)充分拌匀。在生化培养箱中进行30℃培养，适时翻曲，制曲48h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。

发酵工艺：将成曲与含200g·l^-1nacl的盐水以体积比1:1.8的比例混合。将混合均匀后的酱醪分装入500ml烧杯中，30℃发酵30天。发酵第1周每天搅拌一次，之后每两天搅拌一次。在第0，5，10，15，20，25，30天进行取样。

强化方式：高盐稀态酱油发酵过程菌株的添加方式为：在发酵第0天时添加10⁷cfu·g^-1鲁氏接合酵母zq-01，并同时添加10⁷cfu·g^-1类肠膜魏斯氏菌lcw-28。

共设置五组实验组，具体实施方式如上，

control组：不加任何菌株；

z.rouxii组：单独强化鲁氏接合酵母；

w.paramesenteroides组：单独强化类肠膜魏斯氏菌；

co-inoculation组：同时强化类肠膜魏斯氏菌与鲁氏接合酵母；

sequentialinoculation：为先接入类肠膜魏斯氏菌等到ph降到5时再接入鲁氏接合酵母。

实施例3：类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01数量的测定

为了确定可以通过添加菌株起到在酱油发酵过程强化类肠膜魏斯氏菌和鲁氏接合酵母的作用，对类肠膜魏斯氏菌和酵母菌数量测定采用平板计数法。称取1g新鲜酱醪或共培养菌液倒入盛有灭菌玻璃珠和99ml生理盐水锥形瓶中混匀，梯度稀释(分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，稀释后涂布到mrs培养基和孟加拉红培养基上，37℃培养1天后计数。类肠膜魏斯氏菌为兼性厌氧菌，平板培养为1-2天出现菌落。而酱醪中优势耐盐细菌为嗜盐四联球菌，平板培养4-6天出现菌落。因此，mrs平板计数时可以和酱醪中优势耐盐细菌(包括weissella、bacillus、staphylococcus)区分。本方法所计算的酵母数量包括添加的鲁氏接合酵母，以及酱醪中耐盐酵母(如球拟酵母，假丝酵母等)。后者与前者相比数量较少，可忽略不计。

结果表明添加类肠膜魏斯氏菌lcw-28，可使酱醪中该类菌数量比未添加类肠膜魏斯氏菌对照增加1.9-3.0个数量级，最高达到1.0×10⁸cfu·g^-1，后期逐渐减少，稳定在1.0×10⁷cfu·g^-1。因此，添加类肠膜魏斯氏菌lcw-28可以起到在酱油发酵过程中提高该菌浓度，起到强化该菌株的作用(图1)。

实施例4：强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01对酱醪样品理化指标的影响

在第0、5、10、15、20、25、30、35和40天对实施例1中的酱醪进行取样。取100g酱醪于离心管中，12000r·min^-1离心30min，取上清液并用孔径为0.22μm的滤膜过滤进行理化指标测定。酱醪ph采用精密ph计直接测定。总酸含量采用酸度计法测定。氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定。还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法(dns)测定。

对高盐稀态酱油发酵过程中酱醪的ph、总酸、还原糖和氨基酸态氮等理化指标分析表明，添加类肠膜魏斯氏菌使酱醪ph略有下降，总酸含量少量增加，而氨基酸态氮含量显著增加，如图2所示，在第40天时，与control组相比强化两菌(co-inoculation组)使酱醪ph下降15％，总酸提高了41.28％，还原糖下降了132.8％，氨基态氮提高了97.4％。氨基态氮作为国家酱油品质的主要评判标准，共同强化两菌能够显著提高其含量。

实施例5：强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01对游离氨基酸的影响

游离氨基酸采用高效液相色谱法测定，采用邻二甲苯(opa)进行柱内衍生化，具体测定方法参照文献。使用5％的三氯乙酸把酱油过滤液稀释20倍，暗处理30min后，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤后取1ml样品待测。此操作可以除去蛋白质对测定结果的干扰。色谱条件：色谱仪agilent1260，色谱柱odshypersil(250mm×4.6mm×5μm)。流动相a和流动相b现用现配，使用前进行过滤并超声30min以上。流动相a相：5g·l^-1乙酸钠溶液(含0.2ml·l^-1三乙胺，5ml·l^-1四氢呋喃)，用乙酸调ph至7.2。流动相b相：5g·l^-1乙酸钠-甲醇-乙腈溶液，体积比为1:2:2。

游离氨基酸对发酵食品尤其是以蛋白为主要发酵基质的大豆发酵食品独特滋味和香气的形成具有重要贡献。游离氨基酸含量是衡量酱油品质的主要理化指标之一。谷氨酸为鲜味氨基酸是酱油鲜味主要的游离氨基酸。甘氨酸和苏氨酸为甜味氨基酸。与control组相比强化两菌(co-inoculation组)游离氨基酸总含量提高了33.15％。其中谷氨酸提高了50％，赖氨酸提高56.39％，甘氨酸提高38.62％，苏氨酸提高70.79％。

表2强化类肠膜魏斯氏菌与鲁氏接合酵母游离氨基酸的变化(mg·ml^-1)

实施例6：强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01对有机酸含量的影响

有机酸采用高效液相色谱法测定，具体方法参考文献。使用超纯水把酱醪过滤液稀释10倍后，用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤后取1ml样品待测。色谱条件：液相系统：agillent1260；色谱柱：有机酸柱；紫外检测器：210nm；进样体积：10μl；流动相：5mmol·l-1稀硫酸；柱温：40℃；洗脱速度：0.5ml·min^-1；分离时间：30min。

酱油中由乳酸菌产生的有机酸不仅是酱油风味物质的重要组成部分，也起到抑制酱醪中腐败菌或杂菌生长的作用，在第40天时，与control组相比，强化两菌(co-inoculation组)有机酸的总含量提高了72.76％。其中为短链饱和脂肪酸的丙酸提高了1.43倍(图3)。

实施例7：强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28和鲁氏接合酵母zq-01对风味物质含量的影响

挥发性风味物质采用固相微萃取联合气质联用技术(spme-gc-ms)进行测定，具体方法参考文献。发酵结束时每个样品取三个平行样，过滤混匀后准确量取5ml酱油样品放置于20ml顶空进样瓶中，添加83.36μg·l^-1的2-辛醇作为内标，混匀后立刻密封，进行测定。测定后将样品质谱图与nist2.0标准谱库比对鉴定。根据保留指数(ri)对挥发性物质进行定性。根据内标2-辛醇的面积对挥发性物质进行定量分析。

在酱油发酵过程中强化类肠膜魏斯氏菌或其与鲁氏接合酵母可使酱油中主要风味物质(醇、酸、酯、酚、醛等)含量显著增加，尤其是共同添加两菌时，风味物质含量增加最多。同时强化两菌时与control组相比挥发性风味物质总含量提高了2.12倍。其中醇类提高1.39倍，酸类提高2.39倍，醛类提高2倍。其中酱油的表征风味物质4-乙基愈创木酚提高了1.58倍，hemf提高了2.73倍。

表3不同酱油样品中主要差异挥发性物质含量(g/kg)

表4不同酱油样品中主要挥发性物质含量(g/kg)

对比例：不同魏斯氏菌与鲁氏接合酵母zq-01共同强化对酱醪样品风味物质含量的影响

取实施例1中筛选到的其他魏斯氏菌如融合魏斯氏菌weissellaconfusa(实验组1)、食窦魏斯氏菌weissellacibaria(实验组2)分别与鲁氏接合酵母zq-01共同强化制备酱油，具体实施方式同实施例2和7。如表5所示，选择其他两株实施例1中筛选得到的魏斯氏菌与鲁氏接合酵母zq-01共同强化，风味物质含量相对共同强化类肠膜魏斯氏菌lcw-28与鲁氏接合酵母zq-01减少了约50％。

表5不同酱油样品中主要挥发性物质含量(g/kg)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。