一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌Z-13菌株及其应用

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌z-13菌株及其应用。

背景技术：

根腐病是设施果蔬生产上危害最为严重的土传病害之一，尤其以黄瓜、番茄等葫芦科和茄科蔬菜根部病害尤为严重，一般会导致产量损失10％-15％以上，有时可达30％-40％以上，甚至绝收。根腐病主要发生在植株的茎基部和根部，在整个生育期均可发病，侵害植株根部维管组织使植株死亡，其中镰孢菌(fusariumspp.)引发的根腐病尤为常见。据报道尖孢镰孢菌(f.oxysporium)是引起土传病害的优势种群。

目前，蔬菜根部病害的防治仍以化学防治为主，但由于高毒、高残留、污染环境等诸多弊端，越来越多的化学农药被逐渐限制使用。生物防治绿色环保，病原菌不易产生耐药性。生防菌剂生产工艺较简单、且能促进作物生长，应用前景广阔。

技术实现要素：

针对化学防治蔬菜根部病害具有高毒、高残留、污染环境等诸多弊端的技术问题，本发明提供一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌z-13菌株及其应用。该地衣芽孢杆菌z-13菌株对引起果蔬根腐病的常见病原菌具有显著的拮抗作用，并具有较强的产生3-吲哚乙酸(iaa)和嗜铁素的能力，既能够有效防治果蔬根腐病，又能够促进植物对营养物质的吸收，促进植物生长。

为解决上述技术问题，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌z-13菌株，其分类名称为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)，于2020年9月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.20823；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的地衣芽孢杆菌z-13菌株从非感病地块黄瓜根际土壤中分离得到，属于芽孢杆菌属，其对引起果蔬根腐病的常见病原菌具有显著的拮抗作用，能够有效防治果蔬根腐病。同时，该地衣芽孢杆菌z-13菌株还具有较强的产生3-吲哚乙酸(iaa)和嗜铁素的能力，能够促进植物对营养物质的吸收，从而促进植物生长。其16srdna序列如seqidno.1所示。

该地衣芽孢杆菌z-13菌株的筛选方法具体包括以下步骤：

①取未感病地块的黄瓜根际土壤中分离产芽孢细菌，然后从中筛选对尖孢镰刀菌有抑制作用的拮抗菌菌株；

②将步骤①得到的拮抗菌菌株在na斜面培养基上活化，将活化的菌株接种于nb培养基，37℃恒温振荡培养过夜。离心收集菌体，用无菌水洗涤并重悬于等体积的msgg培养基中。吸取msgg培养基菌悬液在37℃静置培养，从中筛选出具有显著的生物膜生成能力的拮抗菌菌株；

③将步骤②得到的拮抗菌菌株转接到nb培养基中，37℃摇床振荡培养24h后再转接到yma培养基中，37℃摇床振荡培养4d。取培养菌液以10000r/min离心15min，取上清液，加入等量pc比色液，在黑暗中静置0.5h，以培养基为对照，通过分光光度法筛选出具有产生iaa能力的拮抗菌菌株；

④将步骤②得到的拮抗菌菌株点接在cas蓝色定性检测培养基上，37℃恒温培养箱中倒置培养3d，筛选出具有产生嗜铁素能力的拮抗菌菌株；从中选择既能产生iaa、又能产生嗜铁素的拮抗菌菌株；

⑤将步骤④得到的既能产生iaa、又能产生嗜铁素的拮抗菌菌株接种于na斜面培养基，37℃恒温培养过夜进行活化，挑取菌苔接种nb培养基，37℃恒温振荡培养过夜，按照10％接种量将菌液接种于种子培养基中，37℃恒温振荡培养48h，离心回收上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液。以禾谷丝核菌(rhizoctoniacerealis)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、禾旋孢腔菌(cochliobolussativus)、假禾谷镰刀菌(fusariumpseudograminearum)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、大丽轮枝菌(verticilliumdahliae)为指示菌，通过琼脂扩散法筛选对滤液进行检测，得到所述地衣芽孢杆菌z-13菌株。

第二方面，本发明实施例还提供上述地衣芽孢杆菌z-13菌株在防治果蔬根腐病中的应用。

本发明提供的地衣芽孢杆菌z-13菌株及其分泌物具有对引起果蔬根腐病的多种病原菌均有显著的拮抗作用，能够有效防治果蔬根腐病。田间试验数据证明，地衣芽孢杆菌z-13菌株对黄瓜、番茄和草莓根腐病均具有显著的防治效果。

第三方面，本发明实施例还提供一种防治果蔬根腐病的方法，将果蔬幼苗在浓度为0.5×10⁹～1.5×10⁹cfu/ml的所述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵菌液中浸泡10～20min后再种植。

优选地，所述方法还包括在种植所述果蔬幼苗后18～42天用浓度为0.5×10⁹～1.5×10⁹cfu/ml的所述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵菌液进行至少一次灌根处理。灌根用量以8～12l/hm²为宜。

优选地，所述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵菌液的制备方法包括：将所述地衣芽孢杆菌z-13菌株接种到na斜面培养基，37℃恒温培养12～24h进行活化，挑取活化菌苔接入nb培养基中，37℃摇床振荡培养12～24h，以10％的接种量将培养物接种到nb培养基，37℃摇床振荡培养48～60h，用无菌水调节发酵液中芽孢浓度至0.5×10⁹～1.5×10⁹cfu/ml，即得所述发酵菌液。

第四方面，本发明实施例还提供一种菌剂，所述菌剂包括上述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵物。

该菌剂可用于处理果蔬幼苗或灌根、穴施，以达到防治果蔬根腐病、促进果蔬生长的作用。

优选地，所述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵物的制备方法包括：将所述地衣芽孢杆菌z-13菌株接种到na斜面培养基，37℃恒温培养12～24h进行活化，挑取活化菌苔接入nb培养基中，37℃摇床振荡培养12～24h，以10％的接种量将培养物接种到nb培养基，37℃摇床振荡培养48～60h。

附图说明

图1为实施例1中分离的部分芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用检测结果；

图2为实施例1中z-13菌株的发酵上清液对植物病原真菌的抑制作用；

图3为实施例1中z-13菌株的菌体形态特征；

图4为实施例1中z-13菌株的菌落形态特征；

图5为实施例1中z-13菌株及相关菌株的系统发育树。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所采用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

以下实施例中所采用的原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。

以下实施例中试验数据采用spss13.0软件进行分析，用单因素anova进行方差分析，结果均以平均数±标准差表示，并用duncan法进行多重比较。

实施例1

本发明实施例提供了一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌z-13菌株，该菌株通过以下步骤筛选得到：

1、培养基和试剂

1.1培养基配方

马铃薯葡萄糖(pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。将马铃薯去皮，切成小块，加水煮沸0.5h，用双层纱布过滤，取其滤液加葡萄糖和琼脂，并加水补足1000ml。

营养肉汤琼脂(na)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。

营养肉汤(nb)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。

种子培养基：蛋白胨1％，葡萄糖1％，nah2po4·2h2o0.2％，na2hpo4·2h2o0.4％，mgso4·7h2o0.05％，余量为水，ph7.0～7.2。

yma培养基：kh2po40.5g、酵母粉1.0g、甘露醇10.0g、mgso40.2g、nacl0.1g、色氨酸100mg、蒸馏水1000ml，ph6.8～7.2。

cas蓝色定性检测培养基：取0.012gcas(铬天青)溶于10ml蒸馏水中，并与2ml1mmol/lfecl3混匀，得溶液a。称取0.015g的十六烷基三甲基溴化铵溶于8ml蒸馏水中，得到溶液b。将溶液a缓慢加入溶液b中，充分混匀即得染液c。将ph6.8磷酸缓冲液10ml加入盛有75ml蒸馏水的三角瓶中，混匀后用0.2mol/lnaoh调节ph至6.8，再加入1.6g琼脂粉，得培养基d。分别将染液c、培养基d及1mmol/l的氯化钙溶液、1mmol/l的七水硫酸镁溶液、20％葡萄糖、10％的酸水解酪蛋白溶液于121℃灭菌15min，置于50℃水浴锅内保温待用。分别取0.1ml1mmol/l氯化钙溶液、2ml1mmol/l七水硫酸镁溶液、3ml10％酪蛋白氨基酸、1ml20％葡萄糖溶液加入培养基d再沿瓶壁加入10ml染液c，充分摇匀(但勿产生气泡)，即得蓝色定性检测培养基。

msgg培养基：k3po45mmol/l、mops(ph7.0)100mmol/l、mgcl22mmol/l、cacl2700μmol/l、fecl350μmol/l、mncl250μmol/l、zncl21μmol/l、硫胺素2μmol/l、甘油0.5％、谷氨酸5g/l、色氨酸50mg/l、苯丙氨酸50mg/l。

所有培养基均用121℃30min高压蒸汽灭菌。

1.2试剂

pc比色液的配制：称取12g三氯化铁溶于300ml蒸馏水中，缓缓加入429.7ml，98％硫酸，冷却后定容至1000ml，测定范围为0.3～20mg/l。

2、拮抗菌筛选方法

2.1感病地块土壤样品采集

将黄瓜设施大棚中的非感病地块分为4小块，每小块约250m²。从每小块的核心区域分别提取土壤样品，每小块5个重复。每个重复土壤样品取自1m²范围内的2～15cm深度的土壤层。

2.2样品中产芽孢细菌的分离

将非感病地块黄瓜根际土壤样品用无菌研钵碾碎，过2mm筛，称取10g土壤样品放入含有90ml无菌水和玻璃珠的灭菌三角瓶中，摇床振荡1h，将悬浊液80℃水浴加热15min，用无菌水进行10倍系列梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-43个稀释度的稀释液涂布于na培养基，每个平板涂布50μl，37℃恒温倒置培养过夜。

从非感病地块黄瓜根际土壤中共分离产芽孢细菌菌株167株。

2.3拮抗尖孢镰刀菌产芽孢细菌的分离

将28℃恒温培养5d的尖孢镰刀菌用打孔器选取直径0.7cm的小块接种于pda平板培养基中央。将培养过夜的na平板培养基取出，用灭菌竹签挑取2.2中分离得到的不同菌落形态的产芽孢细菌菌株点在距离尖孢镰刀菌菌片2.5cm的pda平板培养基，每个平板接种4株菌，28℃恒温倒置培养5d，观察抑菌圈产生情况。

经检测，共获得78株对尖孢镰刀菌有抑制作用的拮抗菌菌株，部分芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用检测结果如图1所示。

2.4拮抗芽孢杆菌产生生物膜能力检测

将2.3得到的78株拮抗菌菌株接种于na斜面培养基，37℃恒温培养过夜，将活化的菌株接种于nb培养基，37℃恒温振荡培养过夜。离心收集菌体，用无菌水洗涤并重悬于等体积的msgg培养基中。吸取msgg培养基菌悬液于24孔细胞培养板中，每个孔加入2ml，37℃静置培养，观察拮抗菌形成生物膜情况。

经检测，共有39株拮抗菌菌株具有显著的生物膜生成能力。将该39株拮抗菌菌株编号命名，分别为z-1～z-39。

2.5拮抗菌产iaa检测

配制iaa标准溶液，浓度依次为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0mg/l，分别取上述各3-吲哚乙酸溶液4ml并加入4mlpc比色液，黑暗中静置0.5h，取出立即测定od530，另取4ml蒸馏水加入4mlpc比色液用于调零，重复测定3次，获得的数据分别取平均值制作标准曲线。

将2.4得到的39株拮抗菌菌株转接到nb培养基中，37℃摇床振荡培养24h，分别取5ml转接到yma培养基中，37℃摇床振荡培养4d。取培养菌液5ml于离心管中，10000r/min离心15min，取上清液4ml加入等量pc比色液，在黑暗中静置0.5h，取出后立即用分光光度计测定od530，用离心并加入pc比色液的yma培养基作为对照调零，测得各处理样品的od530值并记录，根据标准曲线计算出各菌株产3-吲哚乙酸的量。

经检测，共有24株拮抗菌菌株产生iaa，iaa的产生浓度为6.1～20.5μg/ml。

2.6拮抗菌产嗜铁素能力检测

将cas蓝色定性检测培养基倒板凝固，采用十字划线法将平板分为4个区，用灭菌的竹签沾取2.4得到的39株产芽孢细菌菌株，点接在每个区的中间，37℃恒温培养箱中倒置培养3d。检测并记录拮抗细菌生长的菌落和菌苔周围是否有橙红色晕圈。

经检测，共有14株拮抗菌能产生嗜铁素，其中10株同时具有产生iaa的能力。

2.7拮抗菌无菌滤液对植物病原真菌抑菌谱检测

将2.6筛选得到的10株既能产生iaa，又能产生嗜铁素的拮抗菌接种于na斜面培养基，37℃恒温培养过夜(16h)进行活化，挑取菌苔接种nb培养基，37℃恒温振荡培养过夜(16h)，按照10％接种量将菌液接种于种子培养基中，37℃恒温振荡培养48h，离心回收上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤，回收滤液，即为无菌滤液。以6种主要的引起果蔬根腐病的病原菌禾谷丝核菌、胶孢炭疽菌、禾旋孢腔菌、假禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌为指示菌，通过琼脂扩散法检测拮抗菌无菌滤液的抑菌活性。将病原菌接种到pda斜面培养基，25℃恒温培养7d。将无菌水加入病原菌斜面，用无菌玻璃棒轻刮病原菌，使孢子悬浮。用无菌水调整悬浮液中孢子数量使其浓度为1×10⁶/ml，孢子数量通过血球计数板进行计数。将10ml病原菌孢子悬浮液和100mlpda培养基混合后倒平板。凝固后，在平板上均匀打直径为0.7cm的孔，在每个孔中加入30μl无菌滤液，以培养基作为对照。每个样品3个重复。将平板于25℃恒温培养5d后测量抑菌圈直径。

结果显示，以上10株拮抗菌中，对6株病原指示菌均具有显著拮抗作用的菌株共4株，其中作用最显著的菌株为编号命名为z-13的菌株，如图2所示，其中a中的病原菌是禾谷丝核菌，b中的病原菌是胶孢炭疽菌；c中的病原菌是禾旋孢腔菌；d中的病原菌是假禾谷镰刀菌；e中的病原菌是立枯丝核菌；f中的病原菌是大丽轮枝菌。

3、z-13菌株的种属鉴定

将各方面性能较为良好的z-13菌株进行种属的鉴定。

3.1拮抗菌菌落和菌体形态观察

将2.7筛选得到的z-13菌株在na培养基划线接种，37℃恒温培养过夜，观察菌落形态。菌体形态观察采用染色法，利用番红染色，在100×物镜显微镜下观察菌体形态。

在na培养基上，拮抗菌z-13菌株培养初期菌落乳白色，圆形，表面湿润粘稠；培养后期表面干燥有皱褶，中央凹陷，呈火山口状。菌体呈短杆状，常成串出现，可形成椭圆形的中生芽胞，革兰氏染色呈阳性。如图3、图4所示。

3.2拮抗菌16srdna基因序列系统发育分析

提取拮抗菌基因组dna为模板，16srdna序列扩增采用通用引物27f：agagtttgatcctggctcag和1495r：ctacggctaccttgttacga。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据设计的引物的退火温度和扩增片段大小设计pcr反应程序。反应体系为5μl10×pcrbuffer，4μldntp，引物各2μl，0.25μldna聚合酶，1μldna模板，加ddh2o至50μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃饱和延伸10min。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr结果。pcr产物由北京华大基因有限公司进行测序。将测序的16srdna序列在genbank核酸数据库中进行blast比对及同源性比较，用megalign软件中的clustal算法进行序列排序，kimura双参数模型计算进化距离，neighbor-joining法构建系统进化树。

将拮抗菌z-13菌株16srdna序列与genbank中序列进行比较，获得相近的芽孢杆菌属标准菌株的16srdna序列，得到该拮抗菌及相关菌株的进化距离并构建系统发育树，如图5所示。根据16srdna序列相似性分析，确定z-13菌株为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)。

将该地衣芽孢杆菌z-13菌株于2020年9月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.20823；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

本实施例提供了地衣芽孢杆菌z-13菌株防治果蔬根腐病田间试验效果评价。

将地衣芽孢杆菌z-13菌株接种到na斜面培养基，37℃恒温培养过夜(16h)进行活化，挑取活化菌苔接入装有50mlnb培养基的250ml三角瓶，37℃摇床振荡培养过夜(16h)，以10％的接种量将培养物接种到100mlnb培养基，37℃摇床振荡培养48h，用细菌计数板检测发酵液中芽孢含量。利用无菌水调节发酵液中芽孢浓度为1×10⁹cfu/ml，即得地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵菌液。

选取常见的果蔬草莓、黄瓜和番茄为检测对象，通过田间试验检测地衣芽孢杆菌z-13菌株对果蔬根腐病的防治效果。选取草莓、番茄、黄瓜根腐病发生严重的地块，在种植时采用蘸根的方式接种地衣芽孢杆菌z-13菌株：取上述地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵菌液，将草莓、番茄或黄瓜幼苗在该发酵菌液中浸泡15min。种植20d和40d后采取灌根处理的方式再分别接种一次该发酵菌液，用量为10l/hm²。以清水为对照，每个处理重复3次。种植60d后对植株发病情况进行调查和记载。采用对角线五点取样法，每点调查15株，计算发病率、病株防效、病情指数和病指防效。

草莓根腐病发病程度分为6级。0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％＜根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％＜根系发病率≤80％；叶片变黄，4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎，5级为整株死亡，叶片干枯。

番茄和黄瓜根腐病发病程度分为5级，其分级标准为：0级根部不变色；1级根部轻微变色，变色面积不超过根部总面积的25％；2级根部变色面积达到根部总面积的26％～50％；3级根部变色面积达到根部总面积的51％～75％；4级根部变色面积达到根部总面积的76％以上或者植株死亡。

发病率(％)＝发病株数/调查总数×100。

病株防效(％)＝(对照发病率－处理发病率)/对照发病率×100。

病情指数＝[∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)]×100。

病指防效(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。

其中病指防效即可代表该菌株的防治效果。

田间防治效果试验结果显示，地衣芽孢杆菌z-13对黄瓜根腐病的病指防效为64.80％，对番茄根腐病的病指防效为64.31％，对草莓根腐病的病指防效为65.30％，如表1～表3所示。该结果说明，地衣芽孢杆菌z-13菌株对黄瓜、番茄和草莓根腐病均具有显著的防治效果。

表1地衣芽孢杆菌z-13对黄瓜根腐病的防治效果

表中数据为平均数±标准差。同列数据后不同字母表示经duncan法检验在p<0.05水平差异显著，下同。

表2地衣芽孢杆菌z-13对番茄根腐病的防治效果

表3地衣芽孢杆菌z-13对草莓根腐病的防治效果

实施例3

本实施例提供了一种菌剂，该菌剂为地衣芽孢杆菌z-13菌株的发酵物，该发酵物的制备方法为：将实施例1所得地衣芽孢杆菌z-13菌株接种于na斜面培养基，37℃恒温培养过夜(16h)进行活化，挑取活化菌苔接种于nb培养基，37℃恒温振荡培养过夜(16h)，以10％接种量将菌液接种于nb培养基中，37℃恒温振荡培养48h，用无菌水调节发酵液中芽孢浓度至0.5×10⁹～1.5×10⁹cfu/ml，灌封，即得。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>河北冀微生物技术有限公司，河北农业大学

<120>一种防治果蔬根腐病的地衣芽孢杆菌z-13菌株及其应用

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