一种酿酒酵母以及提高酿酒酵母产γ-氨基丁酸的方法

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种酿酒酵母以及提高酿酒酵母产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术：

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,gaba)是一种非蛋白质氨基酸，在哺乳动物脑组织中作为一种重要的神经抑制性递质，具有镇静神经、改善睡眠、调节激素分泌、改善脑机能等重要生理活性功能。由于gaba的有效生理功能，采用微生物发酵合成法，从自然界中筛选获得产gaba的安全、功能性微生物菌株，并利用其发酵制备富含gaba的发酵产品是一种安全、低成本的有效方法。

酵母菌作为公认的食品级安全微生物，是发酵食品中重要的发酵剂，其中的不少菌株对人和动物有保健和治疗功效，与人和动物的生命活动紧密相关。因此，筛选获得高产gaba的酵母并利用其作为发酵菌株开发富含gaba的发酵食品已成为研究的热点。

影响微生物合成gaba的因素一方面与菌株的自身特性有关，另一方面与外界环境的理化和生物条件有关。这些条件直接或间接的影响微生物合成gaba的能力。目前，主要通过培养条件和培养基的优化、物理和化学因素诱变微生物、基因工程菌的构建及不同微生物菌株共培养技术等提高发酵微生物的gaba产量。而目前，以能产gaba的功能性酿酒酵母为发酵微生物，通过在酿酒酵母发酵培养基中添加植物乳杆菌无细胞发酵上清液，以提高gaba产量未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术不足，本发明以从自然发酵水果样品中培养、筛选获得的具有共生作用的产gaba的功能性酿酒酵母和植物乳杆菌为发酵微生物，通过外源添加植物乳杆菌无细胞发酵上清液以提高gaba产量。

本发明的目的在于提供从自然发酵水果样品中分离、培养、经过鉴定的产γ-氨基丁酸的酿酒酵母sc-125(已于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏编号为cgmcc21236)，和与该酵母菌株具有共生作用的植物乳杆菌m912(已于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为植物乳杆菌lactobacillusplantarum，保藏编号为cgmcc21237)，通过在产gaba酿酒酵母sc-125发酵培养基中添加植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液，以提高gaba产量，改善单一酿酒酵母sc-125发酵合成gaba产量过低的问题。

具体的，产gaba酿酒酵母sc-125和乳酸菌株m912，采用富集培养法分离于传统发酵四川泡菜，再经过培养，分别经18srrna和16srrna鉴定为酿酒酵母和植物乳杆菌。对菌株的产gaba能力研究，产gaba酿酒酵母sc-125菌株在含5g/ll-谷氨酸钠的培养基中其产gaba的能力为1.12g/l。

具体的技术方案为：

一种提高酿酒酵母产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

(1)植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液制备：植物乳杆菌m912在mrs液体培养基中活化，30℃，培养10-12h至对数生长期。10000g,4℃离心分离10min，收集上清液，0.22μm滤膜过滤后得到植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液。

(2)产gaba酿酒酵母sc-125发酵种子的制备：培养、筛选获得产gaba酿酒酵母经18srrna鉴定，酵母菌株在含5g/ll-谷氨酸钠的ypd培养基中活化，30℃，培养约12h至对数生长期。

(3)产gaba酿酒酵母sc-125发酵合成gaba：按5％(v/v)接种量接种产gaba酿酒酵母sc-125于含6g/l-12g/ll-谷氨酸钠的ypd培养基，且ypd培养基中添加8％-9％(v/v)的植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液，于30℃，发酵120-144h。

采用本发明的方法，得到gaba浓度为3.96-7.68g/l；对照组(发酵培养基中未添加无细胞上清液)的产gaba酿酒酵母sc-125发酵得到gaba浓度为1.24-1.60g/l。与对照组相比，gaba产量提高3.19-4.80倍。

附图说明

图1为本发明的基于酵母菌18srrna基因序列构建的菌株sc-125系统发育树；

图2为本发明的基于乳酸菌16srrna基因序列构建的菌株m912系统发育树；

图3为实施例的添加植物乳杆菌m912无细胞上清液对产gaba酿酒酵母sc-125菌体生长的影响；

图中：

■＝产gaba酿酒酵母sc-125(6g/ll-谷氨酸钠)；●＝添加8％无细胞上清液产gaba酿酒酵母sc-125(6g/ll-谷氨酸钠)；

＝产gaba酿酒酵母sc-125(12g/ll-谷氨酸钠)；▼＝添加9％无细胞上清液产gaba酿酒酵母sc-125(12g/ll-谷氨酸钠)；

图4为实施例的添加植物乳杆菌m912无细胞上清液对产gaba酿酒酵母sc-125产gaba的影响；

图中：

■＝产gaba酿酒酵母sc-125(6g/ll-谷氨酸钠)；●＝添加8％无细胞上清液产gaba酿酒酵母sc-125(6g/ll-谷氨酸钠)；

＝产gaba酿酒酵母sc-125(12g/ll-谷氨酸钠)；▼＝添加9％无细胞上清液产gaba酿酒酵母sc-125(12g/ll-谷氨酸钠)。

具体实施方式

结合附图和实施例说明本发明的具体技术方案。

实施例1：

(1)植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液制备：植物乳杆菌m912在mrs液体培养基中活化，30℃，培养12h至对数生长期，菌液浓度为10⁷cfu/ml。10000g,4℃离心分离10min，收集上清液，0.22μm滤膜过滤后得到无细胞上清液。

(2)产gaba酿酒酵母sc-125种子培养制备：将产γ-氨基丁酸的产gaba酿酒酵母sc-125在含5g/ll-谷氨酸钠的ypd培养基中活化，30℃培养至对数生长期，菌液浓度为10⁷cfu/ml。

(3)产gaba酿酒酵母sc-125发酵合成gaba：按5％接种量接种产gaba酿酒酵母sc-125于含6g/ll-谷氨酸钠的ypd液体培养基，ypd液体培养基中添加8％(v/v)的植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液。同时以发酵培养基中未添加无细胞发酵上清液的发酵为对照。分别于30℃，发酵144h，hplc检测分析得到gaba最大浓度为3.96g/l，而对照组gaba浓度为1.24g/l。实验组较对照组gaba发酵合成产量提高了3.19倍。

如图3和图4所示，图3为添加植物乳杆菌m912无细胞上清液对产gaba酿酒酵母sc-125菌体生长的影响，从od600值菌体数量结果分析发现一定浓度的植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液对产gaba酿酒酵母sc-125的生长有明显的促进作用。图4为添加植物乳杆菌m912无细胞上清液对产gaba酿酒酵母sc-125产gaba的影响，从gaba的结果发现，一定浓度的植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液可明显提高产gaba酿酒酵母sc-125的gaba产量。

实施例2：

(1)植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液制备：植物乳杆菌m912在mrs液体培养基中活化，30℃，培养12h至对数生长期，菌液浓度为10⁷cfu/ml。10000g,4℃离心分离10min，收集上清液，0.22μm滤膜过滤后得到无细胞上清液。

(2)产gaba酿酒酵母sc-125种子培养制备：将产γ-氨基丁酸的产gaba酿酒酵母sc-125在含5g/ll-谷氨酸钠的ypd液体培养基中活化，30℃培养至对数生长期，菌液浓度为10⁷cfu/ml。

(3)产gaba酿酒酵母sc-125发酵合成gaba：按5％接种量接种产gaba酿酒酵母sc-125于含12g/ll-谷氨酸钠的mrs液体培养基，ypd液体培养基中添加9％(v/v)的植物乳杆菌m912无细胞发酵上清液。同时以发酵培养基中未添加无细胞发酵上清液的发酵为对照。分别于30℃，发酵144h，hplc检测分析得到gaba最大浓度为7.68g/l，而对照组gaba浓度为1.60g/l。实验组较对照组gaba发酵合成产量提高了4.80倍。