微生物制剂的制作方法

微生物制剂
1.分案说明本发明为申请日为2019年9月29日，申请号为2019109339644，发明名称为“杰米拉类芽孢杆菌、其微生物制剂与制备方法及应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及农业微生物领域，特别涉及一种微生物制剂。


背景技术：

3.番茄是我国生产种植体系中最重要的蔬菜种植作物之一，近年来其生产规模不断扩大，在栽培种植过程中，导致番茄减产的首要病害为番茄青枯病，病原菌为茄科青枯劳尔氏菌（ralstonia solanacearum）。青枯病原菌可通过雨水、浇灌水、地下虫害或操作工具等方式从番茄的根部、茎基部皮孔或伤口侵入并潜伏，待条件适宜时在维管束内迅速繁殖，并沿导管向上扩展，侵入邻近的薄壁细胞组织，导致导管堵塞，植株得不到应有的水分和营养供给而萎蔫死亡。由于该病害传染性极强，病原菌主要在土壤中完成越冬和侵染，其在植株维管束中的致病方式使得传统防治手段束手无策，因此被人们称为“植物癌症”。中国长江以南特别是华南地区是该病害的重灾区，一旦发病难以控制，经常造成番茄植株的大面积枯萎死亡，重病田块严重减产甚至绝收，该病害严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。
4.目前，对番茄青枯病的防治已有诸多报道，比如浇灌农药、作物轮种、抗性育种等，但尚未出现稳定有效的防治措施。近年来，越来越多的研究人员开始在生物防治上寻找突破口，如无致病力青枯菌、假单胞菌、芽孢杆菌、真菌、噬菌体等，由于芽孢杆菌是多种病原菌的拮抗菌，能预防和控制作物病害，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的病害防治途径。然而尽管目前国内外利用生防制剂防治番茄青枯病取得了一定的研究进展，但大多数的生防制剂仍处于试验阶段，在实际应用中存在不少问题，如田间防效不理想、防治时间短、生防菌定殖力低、受环境影响因素大等。
5.因此，需要合适的载体材料来增强其适应性和有效性。粘土矿如伊利石等是组成粘土岩和土壤的主要矿物，粘土颗粒所具有的大比表面积、多孔结构及强吸附性能已经引起越来越多的学者及研究人员的兴趣。伊利石是一种常见的黏土矿物，其成分主要为伊利石，还含有少量的高岭石、蒙脱石、绿泥石、叶蜡试石等。伊利石晶体结构属于2：1型单元层的二八面体型，含有大量的金属阳离子如fe
2+
、mg
2+
、si
2+
等，可以与细菌细胞壁表面的肽聚糖相结合。此外伊利石晶体的大比表面积的特征也使得其具备良好的静电吸附性能，这些特征使得伊利石在水中能够聚集细菌菌体，形成富含菌体的颗粒状物质，而大多数芽孢杆菌在富集时会形成菌膜使得菌体在不良环境中拥有比单个菌体更高的存活率。在生产应用中，生防菌在植株根系周围的存活率会直接影响生防效果，因此，通过伊利石吸附后的菌体相较于单一菌体则具有较高的存活率，从而具有更高的生物防治效果。
6.利用伊利石吸附生防菌可制得微生物制剂，将这种微生物制剂作用于番茄青枯病的防治，有望提高生防菌在自然环境中的成活率和改善其在番茄根系周围的定殖能力，从而防止或减轻青枯病菌侵染造成的番茄病害影响。因此，这种微生物制剂具有可观的生产应用前景。


技术实现要素：

7.发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种微生物制剂，对番茄青枯病具有较高的预防功能。
8.技术方案：本发明提供了一种杰米拉类芽孢杆菌，分类命名为paenibacillus jamilae w51，2018年 10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.16639。
9.本发明还提供了一种杰米拉类芽孢杆菌在防治番茄青枯病中的应用。
10.本发明还提供了一种微生物制剂，包括吸附剂和权利要求1中所述的杰米拉类芽孢杆菌w51；其中，所述杰米拉类芽孢杆菌w51的活菌总浓度为1
×
10
8 ~1
×
10
9 cfu/ml。
11.优选地，所述吸附剂为伊利石粉。
12.优选地，所述伊利石粉在所述微生物制剂中的浓度为4%。
13.优选地，所述伊利石粉的粒度<2
µ
m，自然白度>85%。
14.本发明还提供了一种微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：s1：将杰米拉类芽孢杆菌w51的种子菌液以1:100的体积比接种至pdb发酵培养基中发酵培养；发酵培养的条件为：32℃，200 ~220 rpm振荡培养18 ~32 h；s2：4000~6000 rpm离心25~30min，取沉淀用灭菌水重悬使得制成的菌悬液在600 nm处的 od 值范围为0.8 ~1.0；s3：向所述菌悬液中加入4%的灭菌后的伊利石粉，32℃，200~220 rpm振荡吸附0.5 ~1.0 h，即得所述微生物制剂。
15.进一步地，在所述s1中，所述杰米拉类芽孢杆菌w51的种子菌液的制备方法如下：将杰米拉类芽孢杆菌w51的菌株接种到ypgb培养液中32℃，200 rpm 振荡培养12 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。
16.本发明还提供了一种微生物制剂在防治番茄青枯病中的应用。
17.本发明还提供了一种防治番茄青枯病的方法，使用微生物制剂对番茄进行灌根处理。
18.有益效果：本发明是专门针对番茄青枯病开发的微生物制剂，由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，不易产生抗性；对环境安全，无公害，无残留；专一性强，活性高，生产成本低，制备工艺简单，因而有利于番茄的无公害生产；所用的伊利石粉为廉价的天然粘土矿资源，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留。
19.温室实验结构表明：该杰米拉类芽孢杆菌w51（cgmcc no.16639）微生物制剂能显著降低番茄青枯病的发生。利用杰米拉类芽孢杆菌w51和伊利石粉制备的微生物制剂进行灌根处理，对番茄青枯病的防效可达79.35%。
附图说明
20.图1为实施方式6中微生物制剂对番茄青枯病防效的可视化照片；其中，a为空白对照组番茄青枯病发病情况，b为微生物制剂组番茄青枯病发病情况。
具体实施方式
21.下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
22.实施方式1：本实施方式提供了一种杰米拉类芽孢杆菌w51，该菌株的筛选方法如下：杰米拉类芽孢杆菌w51（cgmcc no. 16639）由江苏省淮安市码头镇番茄根围土中分离获得。将番茄根系切成1cm的小段，用1%的次氯酸钠溶液浸泡5 min，75%的酒精浸泡90 s，无菌水清洗3次（取最后一次清洗的溶液 50 μl 涂于ygpa固体培养基上培养，若48 h 后无菌生长则认为表面消毒干净，无菌）。取5 g消毒好的样品置于研钵中，加入45 ml无菌的0.85% nacl溶液，浸软组织后研磨，用无菌的0.85% nacl 溶液梯度稀释。取10 ‑1、10 ‑
2 、10 ‑
3 三个梯度的稀释液各50 μl 涂于ygpa固体平板培养基上，32℃培养36 h。挑取最大的单菌落接种到新鲜ygpa固体平板培养基上，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用50%甘油保存于
‑
80℃超低温冰箱中。
23.鉴定方法：通过形态特征，生理生化实验和16s rdna序列分析对该菌株进行鉴定形态学特征：革兰氏阳性菌，杆状，产芽孢，菌落为圆形，乳白色，有光泽，表面光滑。
24.16s rrna 基因扩增和序列分析: 杰米拉类芽孢杆菌w51在ygpb培养基中 32℃ 培养至对数期，以13 000 r/min离心10 min收集菌体，按细菌dna提取试剂盒（promega，美国）操作说明提取菌株w51的dna，以提取的dna产物为模板，通过27f和1492r引物进行扩增。引物序列：27f：agagtttgatcctggctcag1492r：ggttaccttgttacgactt从基因组dna中扩增出16s rdna基因片段。pcr产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果如下：cgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcaattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaccggcttttctaggattggctccacctcgcggcttcgcttcccgttgtaccggccattgtagtacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctgcttagagtgcccagcttgacctgctggcaactaagcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtctcctctgtcccgaaggaaaggtctatctctagaccggtcagagggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatactccactgcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggaatgcttaatgtgttaacttcggcaccaagggtatcgaaacccctaacacctagcattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagcccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagctctccagtttccagtgcgacccgaagttgagcctcgggattaaacaccagacttaaagagccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccg
gggctttcttctcaggtaccgtcactcttgtagcagttactctacaagacgttcttccctggcaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcaggctttcgcccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatgcgccgcaggcccatccacaagtgacagattgctccgcctttcctccttctcccatgcaggaaaaggatgtatcgggtattagctaccgtttccggtagttatccctgtcttgtgggcaggttgcctacgtgttactca通过 blast 软件对测定 16s rrna 基因序列进行同源性比较，结果见表1，菌株w51与genbank中报导的杰米拉类芽孢杆菌p. jamilae（kctc13919）的亲缘关系最近，同源性为99.65%，因此，将该菌株鉴定为杰米拉类芽孢杆菌（paenibacillus jamilae）。
25.表1w51测序比对结果菌株最相似菌株及登录号相似度(%)w51paenibacillusjamilaekctc1391999.65上述杰米拉类芽孢杆菌w51，分类命名为 paenibacillus jamilae，于2018年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no. 16639。
26.实施方式2：伊利石吸附剂对w51有效吸附效率测定将杰米拉类芽孢杆菌w51 （cgmcc no. 16639）菌株接种到ypgb培养液中32℃，200 rpm 振荡培养12 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。将w51种子菌液以1：100接种至pdb液体培养基中，32 ℃、200 rpm振荡培养32 h后，4000 rpm离心30 min，弃上清，沉淀用无菌水重悬并使其在600 nm处的吸光度值为0.8。使用蔗糖密度梯度法测定不同比例的伊利石对w51菌体的吸附效果。向w51菌悬液中加入4 %的伊利石粉（粒度<2
µ
m，自然白度>85%，由江苏省益生菌制剂重点实验室提供），于气浴摇床中32 ℃、200 rpm振荡培养0.5 h，取混合液于试管中，向其底部缓慢加入60%的蔗糖溶液，静置2 h后，吸附在伊利石上的菌体由于其质量变大，会下沉至蔗糖溶液的底部，而未被吸附的菌体则继续停留在蔗糖溶液的上层，吸取上层液体稀释涂平板，32 ℃培养12 h后计数单菌落数，吸附率c计算公式如下：其中：m
‑‑‑‑
加入吸附剂后的混合液在蔗糖溶液上层的单菌落数
ꢀꢀꢀꢀꢀ
m
‑‑‑‑
未加入吸附剂的菌悬液在蔗糖溶液上层的单菌落数经计算，4%的伊利石对w51的吸附率为90.39%。
27.实施方式3：杰米拉类芽孢杆菌w51微生物制剂的制备将杰米拉类芽孢杆菌w51 （cgmcc no. 16639）菌株接种到ypgb培养液中32℃，200 rpm 振荡培养12 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:100体积比接种至pdb发酵培养液中发酵培养，32℃，210 rpm 培养28 h，然后4500 rpm离心30 min，取沉淀用灭菌水进行稀释使得制成菌悬液在600 nm处的 od 值为0.8 ，向菌悬液中加入4%的灭菌伊利石粉（粒度<2
µ
m，自然白度>85%，由江苏省益生菌制剂重点实验室提供），32℃，210 rpm振荡培养0.5 h，即得微生物制剂，成品微生物制剂中活菌总浓度为1
×
10
8 ~1
×
10
9 cfu/ml。
28.实施方式4：杰米拉类芽孢杆菌w51微生物制剂的制备将杰米拉类芽孢杆菌w51（cgmcc no. 16639）菌株接种到ypgb培养液中32℃，220 rpm 振荡培养10 h后，每隔2 h在超净工作台中取样测其在600 nm处的od值，当od值为0.8时结束培养，此菌液作为种子菌液。把种子菌液以1:100体积比接种至pdb发酵培养液中发酵培养，32℃，200 rpm 培养32 h，然后5500 rpm离心20 min，取沉淀用灭菌水进行稀释使得制成菌悬液在600 nm处的 od 值范围为1.0 ，向菌悬液中加入4%的灭菌伊利石粉（粒度<2
µ
m，自然白度>85%），32℃，200 rpm振荡培养1.0 h，即得微生物制剂，成品微生物制剂中活菌总浓度为1
×
10
8 ~1
×
10
9 cfu/ml。
29.实施方式5：温室试验杰米拉类芽孢杆菌w51微生物制剂对番茄青枯病的防效（2018.04
‑
2018.12）地点：淮阴工学院生科学院温室温室盆栽实验：将番茄种子（品种为上海合作903）先用无菌水冲洗两遍，用75%酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的番茄种子在培养皿中培养发芽，72 h后选取发芽的种子播种至穴盆中，当番茄苗生长至5
‑
6片真叶时选取长势一致的苗转移至大盆钵中培养，实验分为空白对照处理组和微生物制剂处理组，每个处理组由36棵番茄苗组成，实验重复三次。30天后向微生物制剂处理组番茄苗根部灌入w51微生物制剂15 ml，空白对照组灌入灭菌水15 ml，一周后接种青枯病原菌（浓度为1
×
10
7 cfu/ml，接种量为30 ml），温室试验条件为：35 ℃，自然光照。7 d后对番茄青枯病的发病情况进行连续观察调查15天。
30.番茄青枯病发病调查依据《番茄抗青枯病鉴定技术规程》(ny/t 1858.4
‑
2010)结合本实验的实际情况，记录分析试验数据。
31.0级，无症状；1级，1片叶枯萎；2级，2
‑
3片叶枯萎；3级，除底部2
‑
3片叶外，其他叶片均枯萎；4级，整株叶片枯萎；调查记载每一株的病情级别，并计算病情指数。
32.病情指数(di)=∑（病级数
×
该病级植株数）/（最高病级数
×
总植株数）
×
100%生防效果=（对照组病害严重度—处理组病害严重度）/对照组病害严重度
×
100%注：计算不同处理的病情指数及防效并利用ibm spss statistics 23数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。
33.在微生物制剂处理15天后，对照组和实验组的发病情况见表1。
34.表1 微生物制剂对番茄青枯病的生防效果结果显示w51微生物制剂温室条件下对番茄青枯病有较好的生物防治效果。用w51微生物制剂处理的番茄苗，青枯病病情指数为17.62%，相对于对照组的85.33%，生防效率达
79.35%。
35.实施方式6：温室试验杰米拉类芽孢杆菌w51微生物制剂对番茄青枯病的防效（2019.02
‑
2019.07）地点：淮阴工学院生科学院温室温室盆栽实验：将番茄种子（品种为上海合作903）先用无菌水冲洗两遍，用75%酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的番茄种子在培养皿中培养发芽，72 h后选取发芽的种子播种至穴盆中，当番茄苗生长至5
‑
6片真叶时选取长势一致的苗转移至大盆钵中培养，实验分为空白对照处理组和微生物制剂处理组，每个处理组由24棵番茄苗组成，实验重复三次。45天后向微生物制剂处理组番茄苗根部灌入w51微生物制剂10 ml，空白对照组灌入灭菌水10 ml，一周后接种青枯病原菌（浓度为1
×
10 7
cfu/ml，接种量为20 ml），温室试验条件为：35 ℃，自然光照。5 d后对番茄青枯病的发病情况进行连续观察调查15天。
36.番茄青枯病发病调查依据《番茄抗青枯病鉴定技术规程》(ny/t 1858.4
‑
2010)结合本实验的实际情况，记录分析试验数据。
37.0级，无症状；1级，1片叶枯萎；2级，2
‑
3片叶枯萎；3级，除底部2
‑
3片叶外，其他叶片均枯萎；4级，整株叶片枯萎；调查记载每一株的病情级别，并计算病情指数。
38.病情指数(di)=∑（病级数
×
该病级植株数）/（最高病级数
×
总植株数）
×
100%生防效果=（对照组病害严重度—处理组病害严重度）/对照组病害严重度
×
100%注：计算不同处理的病情指数及防效并利用ibm spss statistics 23数据分析软件进行差异显著性分析及多重比较。
39.在微生物制剂处理15天后，对照组和实验组的发病情况见图1和表2。
40.表2 微生物制剂对番茄青枯病的生防效果结果显示w51微生物制剂温室条件下对番茄青枯病有较好的生物防治效果。用w51微生物制剂处理的番茄苗，青枯病病情指数为15.83%，相对于对照组的73.90%，生防效率达78.58%。
41.综上所述，本发明采用的微生物制剂效果较好，能够有效防治番茄青枯病，市场应用前景广阔。
42.上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。