用于检测DNA的组合产品的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测dna的组合产品。

背景技术：

核酸检测技术在经历了数十年的发展与近几年的快速成熟后，目前已广泛运用于传染病病原检测(包括细菌、支原体、病毒等)、肿瘤突变检测、遗传病检测、个体基因型检测等各个方面。在多个应用领域，如传染病诊断，核酸检测技术的灵敏度与特异性均大幅优于胶体金/免疫荧光法，是多种诊断的金标准。在众多核酸检测技术之中，基于探针杂交的检测技术为人熟知，其能够搭配多种技术进行使用。

现有的探针通常不具有信号放大能力，且还存在检测不便，灵敏度不高等问题。

技术实现要素：

本发明涉及用于检测dna的组合产品，包括核糖核酸酶hii以及探针；

所述探针为单链探针，探针的部分或全部序列能够与待检测的靶标dna分子互补，且所述探针互补区域内部嵌入一个或多个rna碱基，所述rna碱基将探针互补区域分隔为至少两个区段，每个区段中dna碱基和不妨碍核酸链杂交的碱基替代物的总个数独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个。

本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的组合产品。

本发明还涉及如上所述的组合产品在检测snp中的应用；其中所述探针中所述rna碱基为一个。

本发明还涉及如上所述的组合产品在检测靶dna中的应用，所述靶dna由lamp、near或rpa引物扩增得到。

本发明的有益效果为：

(1)在同样的互补链浓度下，提高被切断探针的占比，增强信号；

(2)使探针切断后的产物片段更短(≤13个碱基)，更容易从互补链上解离，避免切割产物作为引物进行延伸导致互补链被封闭，以便互补链结合新的探针，从而提升系统灵敏度。

(3)体系的兼容性好，可以搭配lamp、near、rpa等多种恒温扩增方法使用，并可在反应前在扩增体系中加入报告系统，不需要增加额外操作与反应，就可以在扩增过程实现结果报告。

(4)结合lamp、near、rpa等恒温扩增方法使用时，和其他等温扩增常用的荧光染料、颜色指示剂比较，探针对扩增产物识别能确保检测结果的特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中探针tm值对检测效果影响的结果图，其中a表示60℃反应的结果，b表示65℃反应的结果；

图2为本发明一个实施例中dna碱基区段长度对切割效果影响的结果图，其中a列表示体系不存在聚合酶的结果，b列表示体系存在聚合酶的结果；

图3为本发明一个实施例中dna碱基区段长度对可报告温度范围的影响结果图；

图4为本发明一个实施例中实时荧光检测sars-cov-2的检测结果图，其中a表示rnasehii报告体系的检测结果，b表示染料法的检测结果；

图5为本发明一个实施例中实时荧光检测sars-cov-2的检测结果图，其中a列表示dna最大间隔区段为12个碱基的探针报告体系的灵敏度检测结果，b列表示dna最大间隔区段为6个碱基的探针报告体系的灵敏度检测结果；

图6为本发明一个实施例中胶体金检测sars-cov-2(显线法)的检测结果图，其中a表示阴性对照，b表示sars-cov-2样本；

图7为本发明一个实施例中胶体金检测sars-cov-2(消线法)的检测结果图，其中a行表示阴性对照，b行表示sars-cov-2样本；

图8为本发明一个实施例中探针长度对单碱基识别的影响测试结果；

图9为本发明一个实施例中实时荧光检测snp位点rs1815739的检测结果图，其中a表示针对tt基因型样本的检测结果，b表示针对cc基因型样本的检测结果，c表示针对ct基因型样本的检测结果；

图10为本发明一个实施例中胶体金检测snp位点rs1815739的检测结果图，其中f、g表示针对tt基因型样本的检测结果，c、d、e表示针对cc基因型样本的检测结果，a、b、h表示针对ct基因型样本的检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及一种用于检测dna的组合产品，包括核糖核酸酶hii以及探针；

所述探针为单链探针，探针的部分或全部序列能够与待检测的靶标dna分子互补，且所述探针互补区域内部嵌入一个或多个rna碱基，所述rna碱基将探针互补区域分隔为至少两个区段，每个区段中dna碱基和不妨碍核酸链杂交的碱基替代物的总个数≤13个。

核糖核酸酶hii(rnasehii)为核糖核酸内切酶，适用于在双链dna内部切刻核糖核酸的5′末端，产生5′磷酸和3′羟基末端。

术语“碱基替代物”为不含有碱基，又连接核酸链上下游保持探针整体的完整性，也不妨碍核酸链杂交的结构。例如，当靶序列中出现不需要被检测的多态性位点，可以通过将探针对应位置的碱基以碱基替代物替换来实现简并分析。碱基替代物常用脱氧核苷酸间隔物(dspacer)或c3间臂(spacer)。碱基替代物的数量可以为1、2、3、4、5、6个。

所述rna碱基可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个，rna碱基可以是单个分散于dna碱基中，也可以成连续的片段分散(每个连续的片段包含至少两个rna碱基)于dna碱基中；也可以全部连续插入探针的中部。

在一些实施方式中，每个区段中dna碱基或碱基替代物个数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个。

在一些优选的实施方式中，rna碱基尽可能分散地分布在探针中，以提高切割产物解离成单链的效率。

在一些优选的实施方式中，rnasehii的反应温度为55～65℃，rna碱基以3～8个碱基距离的间隔分布在探针中。

在一些实施方式中，所述探针仅包含rna碱基和dna碱基。

在一些实施方式中，每个区段中dna碱基或碱基替代物个数为0～10个。

在一些实施方式中，每个区段中dna碱基或碱基替代物个数≤6个。

探针的断裂可通过本领域技术人员公知的方法进行检测，如通过电泳等手段观察核酸片段条带的大小。在一些优选的方式，探针被标记，通过标记物来判断探针是否发生断裂。

在一些实施方式中，所述探针tm值所示温度≥核糖核酸酶hii切割反应的反应温度-10℃。

在一些实施方式中，至少两个区段中标记有不同的可检测的识别原件，所述识别原件为特定的核酸序列，或是标记在碱基和/或核酸骨架上的标记物；当所述探针从所述rna碱基处被核糖核酸酶hii切开时，所述标记物产生可检测的信号。

在一些实施方式中，标记物标记在所述探针的两个末端碱基上。

在一些实施方式中，所述标记物包括荧光基团和淬灭基团，且至少一个应该基团和至少一个淬灭基团位于不同的区段。

探针切断后荧光基团和淬灭基团被分开，荧光增强，通过荧光增强指示靶标核酸的存在。荧光基团可以包括fam、hex、cy3、cy5、fitc等，淬灭基团可以包括bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、dabsyl等。

在一些优选的实施方式中，多个rna碱基之间可以添加多个修饰，以实现降低本底、增强信号等效果。如，探针5’→3’方向分别进行“bhq1——rna碱基——fam——rna碱基——bhq1”标记，降低阴性的本底信号。

在另外一些实施方式中，所述探针一端固定在固相载体表面，或反应完成后与固相载体结合，另一端偶联信号物质。

通过信号物质的有无，来判断探针是否发生了断裂。

固相载体物质可为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等材质，载体的形式可以是试管、ep管、多孔板(特别是酶标板)、微量反应板凹孔、小珠(特别是磁珠)、小圆片等。

在一些实施方式中，所述组合产品还包括试纸条，其中，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上沿液体流向设置有质检区和检测区：

所述标记物包括第一标记物和第二标记物；

所述样品垫包被有信号物质，所述信号物质标记有所述第一标记物的第一抗标记物；

所述质检区固定包被有针对所述第二标记物的第二抗标记物；

所述检测区固定包被有针对所述第一抗标记物的二抗；

所述第一标记物与所述第一抗标记物、所述第二标记物与所述第二抗标记物能够形成不同的标记物-抗标记物复合物；

或，所述试纸条包括样品垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上沿液体流向设置有检测区和质检区：

所述标记物包括第一标记物和第二标记物；

所述样品垫包被有信号物质，所述信号物质标记有所述第一标记物的第一抗标记物；

所述检测区固定包被有针对所述第二标记物的第二抗标记物；

所述质检区固定包被有针对所述第一抗标记物的二抗；

所述第一标记物与所述第一抗标记物、所述第二标记物与所述第二抗标记物能够形成不同的标记物-抗标记物复合物。

“二抗”是指针对所述第一抗标记物的抗体。

在一些实施方式中，所述信号物质选自荧光团、比色标记、量子点、胶体金、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、lna/pna、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物和纳米结构；

所述纳米结构包括无机纳米颗粒、nv-center、聚集/组装诱导发光分子、稀土离子配体分子以及多金属氧簇。

利用免疫层析的手段检测探针的降解产物，通过胶体金或量子点等信号物质指示，能指示探针的完整性。

在一些实施方式中，所述标记物-抗标记物复合物中标记物/抗标记物的组合选自生物素或其衍生物/链霉亲和素，生物素或其衍生物/亲和素，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白，半抗原/抗体，抗原/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸；

其中生物素的衍生物为d-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素及脱硫生物素中的任一种。

其中抗原和半抗原可以是多肽，也可以是蛋白或蛋白亚基，这样的蛋白或蛋白亚基本身也可以是抗体或抗体片段。

“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scfv-fc等。抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。

在一些优选的实施方式中，探针的rna碱基的两侧核酸序列中分别标记生物素和地高辛，纳米金颗粒上标记地高辛单抗，硝酸纤维素膜上固定链霉亲和素，通过免疫层析的手段检测探针的完整性。靶标存在使探针切断最终导致链霉亲和素线上的颜色消失。

在一些实施方式中，所述探针的3’末端包含不可延伸的封闭部分。

封闭的基团可以选自氨基、磷酸化、间臂(spacer)、生物素等修饰方式；也可以通过将荧光基团、淬灭基团等标记与3’末端从而实现封闭；也可以探针的5’和3’末端的其中一段延长加入与另一端反向互补的3～8个碱基序列，或是5’和3’末端同时延长加入反向互补的3～8个碱基序列，使探针自身形成发夹结构，并在两个末端分别标记荧光和淬灭基团，以降低阴性的本底信号。

在一些实施方式中，通过在探针的3’末端加入与靶标序列无关的核酸序列，实现3’末端的封闭。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、c9间臂(spacer9)、c18间臂(spacer18)、双脱氧间臂[1’,2’-dideoxyribose(dspacer)]、c3间臂(c3spacer)中的任一种。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自c3间臂。

在一些实施方式中，所述rna碱基为一个，所述探针长度小于25nt。

在一些实施方式中，其还包括lamp引物、near引物或rpa引物。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的组合产品。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有核糖核酸酶hii的酶切缓冲液、dna聚合酶、dntp、扩增缓冲液等成分。

本发明还涉及如上所述的组合产品在检测snp中的应用。

在用于snp检测时，所述探针中所述rna碱基为一个，且与snp位点配对(可与野生型或突变型配对)。

rnasehii针对的靶标为双链dna，对双链中碱基的配对程度有一定要求，双链中的错配碱基会影响切割效率，错配碱基的位置越接近切割位置，切割的效率越低，当rna碱基位置发生错配时，切割效率仅有约1/10的水平。得益于此，加上报告体系中存在信号扩增，单个dna单链分子可以诱发多条探针的切割，扩增可以使完全匹配和错配之间的信号差进一步拉大，最终结果能有效地区分单个碱基的差异，用于snp检测。

在一些实施方式中，在检测snp时，所述核糖核酸酶hii切割反应的反应温度≤tm值所示温度+10℃。

体系中包含针对同一snp位点不同等位型的多条探针，每条探针上标记对应不同荧光通道的荧光基团，以及与荧光基团配对的淬灭基团，可以实现单管反应检测样本的基因型。

本发明还涉及如上所述的组合产品在检测靶dna中的应用，所述靶dna由lamp、near或rpa引物扩增得到。

该报告体系可以附加在现有扩增手段的最后，进行终点产物的检测，如将near、lamp、rpa等产物直接加到rnasehii和探针的反应体系进行反应和结果判断。在与扩增手段兼容的前提下，也可以直接和扩增技术进行混合，边产生靶标的核酸，边识别并切割探针，实现最快速简便的检测。除了可以直接检测扩增产生的单链靶标dna，对于产物为双链dna的体系，可以通过变性退火等手段使探针和靶序列结合，从而实现检测。

在一些实施方式中，在上述应用中，具体包括：1.核酸扩增；2.反应结束后将部分或全部反应产物加入rnasehii体系中，先通过热变性使双链dna产物解链，再进行探针切割及检测。

在一些实施方式中，在上述应用中，rnasehii、探针加入到扩增体系中，扩增和探针切割同步进行，再检测探针的完整性。例如，信号实时通过荧光检测，或是反应结束后判定终点荧光值，或是反应结束后通过免疫层析等手段确认探针的完整性。

在一些实施方式中，上述应用的反应温度为35℃～45℃，进一步优选使用e.coli来源的rnasehii。

在一些实施方式中，上述应用的反应温度为55℃～65℃，使用嗜热的，如thermusthermophilus、pyrococcusabyssi来源的rnasehii。

在一些实施方式中，每个区段中dna碱基或碱基替代物个数≤6个，所述扩增在35℃～45℃(也可以为36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃)的温度下进行。

通过缩短dna区段长度，使报告能在较低的反应温度运作，使用于rpa等温度较低的扩增系统，应用范围广。

本发明提供的原理为：rnasehii可以特异性地识别dna双链中的rna碱基，并使rna碱基5’方向连接dna碱基的磷酸二酯键断裂，导致dna双链在rna碱基的5’方向产生了一个切口。在生物体内，通过该切割引发dna修复，可去除双链dna中的rna碱基，确保遗传信息的准确性。本发明基于rnasehii对底物严格配对要求的特性，设计了一种单链探针，该探针内部嵌入了一个或多个rna碱基，并将rnasehii应用于扩增系统的报告体系中。由于rnasehii只能识别和切割双链，因此不会作用于单链的探针。在合适的温度下，当环境中存在与探针互补配对的单链dna，探针会与之杂交，并被rnasehii在特定位置切断，被切断的探针熔解温度下降，无法保持与互补单链dna稳定结合并解离出来，互补的单链可以结合新的探针开始新一轮循环，实现信号的扩大。整个过程中，通过rnasehii的切割，把与探针互补单链dna的输入转化成探针断裂的输出，通过碱基的互补配对原则确保生成的产物的特异性，同时实现信号的放大，通过检测探针断裂的情况获得检测结果。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1tm值对反应效率的影响

在不同的反应温度下测试探针长度对于检测效果的影响。

一、引物探针设计

表1探针tm值与反应效率测试引物和探针序列

表1中complement为靶标序列，probe-tm-59.5和probe-tm-54.8为两条tm值不同的探针，序列均与complement反向互补。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中probe-tm-59.5探针的t修饰淬灭基团，g为rna碱基，c修饰荧光报告基团；probe-tm-54.8探针的t修饰淬灭基团，g为rna碱基，c修饰荧光报告基团。

二、切割反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、9mmmgso4、1μgrnasehii、0.02μmcomplement，0.2μmprobe-tm-59.5或probe-tm-54.8。

反应条件：65℃/60℃，1min，35cycles(每隔1min收集荧光)

三、结果分析

结果如图1所示。在60℃时，probe-tm-59.5和probe-tm-54.8的荧光增长速率都比较快，在35min时两者的荧光值较为接近，但随着反应温度上升到65℃，probe-tm-54.8的反应速率明显地下降，结果表明比反应温度低太多的探针tm值使其难以和互补的模板结合，导致只能产生少量荧光。

实施例2dna碱基区段长度对切割效果的影响

针对一段靶标序列设计多种探针，探针的基础序列一致，区别在于，被rna碱基分隔的dna碱基区段长度。将探针:靶序列按照100:1的摩尔浓度加入，分别在有/无dna聚合酶的状态下切割，以对比dna碱基区段长度对切割效果的影响。

一、引物探针设计

表2dna碱基区段长度对切割效果测试引物和探针序列

表2中探针-区段≤2、≤5、≤10、≤13、≤15为五条被rna碱基分隔的dna碱基区段长度不同的探针，序列均与靶序列反向互补。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中探针-区段≤2的a、u为rna碱基；探针-区段≤5的a、u为rna碱基；探针-区段≤10的a、u为rna碱基；探针-区段≤13的a为rna碱基；探针-区段≤15的c为rna碱基；另外，五条探针的5’末端均修饰淬灭基团，3’末端均修饰荧光报告基团与c3spacer。

二、切割反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、1.7mmdntp、9mmmgso4、8ubst2.0warmstart、1μgrnasehii、20nm靶序列、分别200nm探针-区段≤2、探针-区段≤5、探针-区段≤10、探针-区段≤13、探针-区段≤15五条探针。

反应条件：60℃，1min，60cycles(每隔1min收集荧光)。

四、结果分析

结果如图2所示。当体系中不存在dna聚合酶时，所有探针的增长趋势接近，探针的切割效率相当。当体系中存在dna聚合酶时，dna碱基区段长度为5以下的探针荧光增长趋势接近，探针-区段≤10、探针-区段≤13的增长速度依次有所放缓但依然能观察到荧光信号增长，而探针-区段≤15的荧光增长则受到了明显的抑制。提示探针在被rnasehii识别并切割后，其切口上游的部分作为引物，在dna聚合酶的作用下以靶序列作为模板进行延伸，延伸产物以双链dna形式稳定存在，延伸产物中的单链靶序列无法再激活更多探针的切割。而随着dna碱基区段长度缩短，探针在被rnasehii识别后会被切割成更短的片段，使产物tm值下降更多，探针片段无法保持双链状态并游离，靶序列恢复到单链dna状态，可以和新的探针结合并激活下一轮反应，促使信号的放大。dna碱基区段长度为13以下的探针均能有信号提升的效果，长度为5以下时效果最优。

实施例3dna碱基区段长度对可报告温度范围的影响

比较不同dna碱基区段长度探针在37℃下对于切割效果。

一、引物探针设计

表3dna碱基区段长度对可报告温度范围影响测试引物和探针序列

表3中tm-645为靶序列，n-probe-1r、n-probe-3r为被rna碱基分隔的dna碱基区段长度不同的探针，序列均与靶序列反向互补。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中n-probe-1r的5’末端修饰荧光基团，u为rna碱基，3’末端均修饰淬灭报告基团与c3spacer；n-probe-3r的5’末端修饰荧光基团，a、u、a为rna碱基，3’末端均修饰淬灭报告基团与c3spacer。

二、切割反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、1μgrnasehii、20nmtm-645、200nmn-probe-1r或n-probe-3r。

反应条件：37℃，1min，15cycles(每隔1min收集荧光)。

四、结果分析

结果如图3所示。n-probe-1r的dna区段长度为12，n-probe-3r的最长dna区段长度为6。n-probe-3r探针在37℃仍有荧光增长趋势，而n-probe-1r探针的切割效果受到了抑制。说明缩短探针dna碱基区段长度可以增加可报告温度范围，使其能在较低反应温度下也能正常运作。最长dna区段长度为6的探针可以在37℃的体系中工作，可以有效适配rpa等在较低温度进行扩增的反应体系。

实施例4报告体系特异性测试——sars-cov-2的实时荧光检测

使用一套六条引物对靶标进行lamp扩增，通过体系中的rnasehii和探针实时同步报告特异产物的生成。

一、引物探针设计

表4sars-cov-2实时荧光检测报告体系特异性测试引物和探针序列

表4中sars-cov-2-b3、sars-cov-2-bip、sars-cov-2-lb、sars-cov-2-f3、sars-cov-2-fip、sars-cov-2-lf为sars-cov-2扩增引物，sars-cov-2-probe-f为sars-cov-2检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，探针sars-cov-2-probe-f的t修饰淬灭基团，a为rna碱基，c修饰报告荧光基团，3’末端修饰c3spacer。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、9mmmgso4、1.7mmdntp、8ubst2.0warmstart、1.6μmsars-cov-2-bip/sars-cov-2-fip、0.4μmsars-cov-2-lb/sars-cov-2-lf/sars-cov-2-b3/sars-cov-2-f3。其中，rnasehii的检测体系还包括1μgrnasehii、0.2μmsars-cov-2-probe-f，染料法的体系还包括0.5×lampfluorescentdye。

反应条件：63℃，1min，40cycles(每隔1min收集荧光)。

三、结果分析

结果如图4所示。用染料进行指示时，阴性对照也会有非特异的信号产生，而使用rnasehii和探针做报告体系时，能保证阴性对照没有非特异信号发生，特异性高。

实施例5报告体系放大效果测试——sars-cov-2的实时荧光检测

针对同一组lamp扩增引物，分别设计靶序列一致，但dna区段长度不同的探针，对比区段长度对反应灵敏度的影响。

一、引物探针设计

表5sars-cov-2实时荧光检测报告体系放大效果测试引物和探针序列

表5中sars-cov-2-b3、sars-cov-2-bip、sars-cov-2-lb、sars-cov-2-f3、sars-cov-2-fip、sars-cov-2-lf为sars-cov-2扩增引物，sars-cov-2-probe-12、sars-cov-2-probe-6为sars-cov-2检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中探针sars-cov-2-probe-12的5’末端修饰淬灭基团，a为rna碱基，3’末端修饰报告荧光基团与c3spacer；sars-cov-2-probe-6的5’末端修饰淬灭基团，g、a、g为rna碱基，3’末端修饰报告荧光基团与c3spacer。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、9mmmgso4、1.7mmdntp、8ubst2.0warmstart、1.6μmsars-cov-2-bip/sars-cov-2-fip、0.4μmsars-cov-2-lb/sars-cov-2-lf/sars-cov-2-b3/sars-cov-2-f3。其中，rnasehii的检测体系还包括1μgrnasehii、0.2μmsars-cov-2-probe-12或sars-cov-2-probe-6。

反应条件：63℃，1min，60cycles(每隔1min收集荧光)。

三、结果分析

结果如图5所示。最大间隔区段为12和6碱基的两条探针，分别搭配同样引物组合检测不同浓度的质粒dna。使用sars-cov-2-probe-12探针的分组只能稳定检出1000copies/ml的质粒，而sars-cov-2-probe-6探针的分组则能稳定检出100copies/ml的质粒。因此，在与扩增反应联用时，通过缩短dna区段长度促使切割产物的解离，对方法有提升灵敏度的有益效果。

实施例6报告体系应用实例-sars-cov-2胶体金检测(显线法)

使用一套六条引物对靶标进行lamp扩增，随着产物增加，体系中的rnasehii同步切割探针。lamp反应后，如无靶标存在，探针保持完整，如有靶标存在，探针被切断。胶体金试纸条上，金标垫中含有标记了地高辛抗体的纳米金颗粒，质控线上固定了链霉亲和素，检测线上固定了二抗。当探针完整时，纳米金颗粒上的抗体和链霉亲和素分别识别探针上的两个标记，形成夹心，使得纳米金颗粒被捕获于质控线从而显色，同时，由于绝大部分纳米金颗粒都在质控线被捕获，使得检测线不显色；当探针被切断，链霉亲和素只能捕获到被切断的半断探针，无法捕获纳米金颗粒，切断的探针越多，质控线捕获的纳米金颗粒越少，越多的金流到检测线被二抗捕获，检测线的颜色越深。靶标序列存在，检测线显色，靶标序列不存在，检测线不显色。

一、引物探针设计

表6sars-cov-2胶体金检测(显线法)引物和探针序列

表6中sars-cov-2-b3、sars-cov-2-bip、sars-cov-2-lb、sars-cov-2-f3、sars-cov-2-fip、sars-cov-2-lf为sars-cov-2扩增引物，sars-cov-2-probe-lfb为sars-cov-2检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，探针sars-cov-2-probe-lfb的5’末端修饰地高辛，a为rna碱基，3’末端修饰生物素。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、9mmmgso4、1.7mmdntp、8ubst2.0warmstart、1μgrnasehii、1.6μmsars-cov-2-bip/sars-cov-2-fip、0.4μmsars-cov-2-lb/sars-cov-2-lf/sars-cov-2-b3/sars-cov-2-f3、0.2μmsars-cov-2-probe-lfb。

反应条件：63℃，30min。

三、胶体金检测

将试纸条样本垫一端插到装有扩增产物的ep管中，使其开始层析，10min进行结果判读。

四、结果分析

结果如图6所示。阴性对照中，探针保持完整，抗体标记纳米金颗粒-探针-链霉亲和素形成夹心，纳米金颗粒被捕获在检测线上，检测线显色；检测sars-cov-2样本时，探针随着反应被切断，因而无法在检测线将纳米金颗粒捕获，检测线不显色。

实施例7报告体系应用实例-sars-cov-2胶体金检测(消线法)

使用一套六条引物对靶标进行lamp扩增，随着产物增加，体系中的rnasehii同步切割探针。lamp反应后，如无靶标存在，探针保持完整，如有靶标存在，探针被切断。胶体金试纸条上，金标垫中含有标记了地高辛抗体的纳米金颗粒，检测线上固定了链霉亲和素，质控线上固定了二抗。当探针完整时，纳米金颗粒上的抗体和链霉亲和素分别识别探针上的两个标记，形成夹心，使得纳米金颗粒被捕获于检测线从而显色，当探针被切断，链霉亲和素只能捕获到被切断的一半探针，无法捕获纳米金颗粒，检测线不显色。靶标序列不存在，检测线显色，靶标序列存在，检测线消失。金标垫上固定的金纳米颗粒是过量的，不管检测线是否能捕获到纳米金颗粒，都有富余的纳米金颗粒和质控线上的二抗结合使之显色，以证明试纸条正常反应。

实施例中分别使用了sars-cov-2-probe-lfb和sars-cov-2-probe-multir两种探针，前者为单rna碱基，后者为多rna碱基间隔dna区段长度更短，以对比短区段设计的益处。

一、引物探针设计

表7sars-cov-2胶体金检测(消线法)引物和探针序列

表7中sars-cov-2-b3、sars-cov-2-bip、sars-cov-2-lb、sars-cov-2-f3、sars-cov-2-fip、sars-cov-2-lf为sars-cov-2扩增引物，sars-cov-2-probe-lfb和sars-cov-2-probe-multir为sars-cov-2检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中探针sars-cov-2-probe-lfb的5’末端修饰地高辛，c为rna碱基，3’末端修饰生物素；sars-cov-2-probe-multir探针的5’末端修饰地高辛，u、c、u为rna碱基，3’末端修饰生物素。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、1.7mmdntp、9mmmgso4、8ubst2.0warmstart、1μgrnasehii、1.6μmsars-cov-2-bip/sars-cov-2-fip、0.4μmsars-cov-2-lb/sars-cov-2-lf/sars-cov-2-b3/sars-cov-2-f3、20nmsars-cov-2-probe-lfb或sars-cov-2-probe-multir。

反应条件：63℃，30min。

三、胶体金检测

将试纸条样本垫一端插到装有扩增产物的ep管中，使其开始层析，10min进行结果判读。

四、结果分析

结果如图7所示。在使用单rna碱基探针sars-cov-2-probe-lfb的测试组中，阳性样本尽管可以引发探针的切断，但是切断不充分，导致检测线的颜色减弱但不能彻底消除；而使用sars-cov-2-probe-multir的测试组，阳性样本的结果中检测线彻底消失，不会造成结果的误判。

实施例8探针长度对单碱基识别的影响

在不同的探针长度下测试对靶标核酸单碱基变化的识别效果。

表8探针长度对单碱基识别的影响测试引物和探针序列

表8中complement-25和mism为靶标序列，均与两条探针反向互补，但mism中与探针rna碱基g对应位置的碱基为t；probe-tm-59.5和probe-加长为两条长度不同的探针，序列均与靶标序列反向互补。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中probe-tm-59.5探针的t修饰淬灭基团，g为rna碱基，c修饰荧光报告基团；probe-加长探针的t修饰淬灭基团，g为rna碱基，c修饰荧光报告基团。

二、切割反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、9mmmgso4、1μgrnasehii、0.02μmcomplement或mism，0.2μmprobe-tm-59.5或probe-加长。

反应条件：60℃，1min，60cycles(每隔1min收集荧光)

三、结果分析

结果如图8所示。probe-tm-59.5可以准确地区别complement-25和mism，只有完全互补的时候才会有荧光增长，单碱基的突变会导致探针无法切割，报告系统的特异性较强，可用于基因突变的检测。probe-加长识别complement-25时会有较强荧光，但是识别mism时也会有一定荧光产生，会造成假阳性。探针长度大于等于25个碱基会导致在snp分析时的非特异切割，导致结果判断不准确。

实施例9报告体系应用于snp检测实例-snp位点rs1815739的实时荧光检测

使用一套六条引物对靶标进行lamp扩增，通过体系中的rnasehii和探针实时同步报告snp位点的基因型。反应体系中同时存在两条探针，分别针对snp位点两个等位基因，标记两个不同的荧光基团，靶标序列snp位点的碱基只能触发完全配对的探针的切割，使产生相应通道的荧光，通过判读两个通道荧光产生的有无，可以获得样本中的基因型。

一、引物探针设计

表9rs1815739的实时荧光检测引物和探针序列

表9中181-f3、181-b3、181-fip、181-bip、181-lf和181-lb为rs1815739位点扩增引物，181-c为针对等位基因c的检测探针，181-t为针对等位基因t的检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中181-c探针的c修饰报告荧光hex基团，g为rna碱基，t修饰淬灭基团，3’末端修饰c3spacer；181-t探针的c修饰报告荧光fam基团，a为rna碱基，t修饰淬灭基团，3’末端修饰c3spacer。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、1.7mmdntp、9mmmgso4、8ubst2.0warmstart、1μgrnasehii、1.6μm181-bip/181-fip、0.4μm181-lb/181-lf/181-b3/181-f3、0.2μm181-c/181-t。

反应条件：63℃，1min，40cycles(每隔1min收集荧光)。

三、结果分析

结果如图9所示。能通过有信号的荧光通道准确判断样本的基因型。

实施例10报告体系应用于snp检测实例-snp位点rs1815739的胶体金检测(显线法)

使用一套六条引物对靶标进行lamp扩增，随着扩增产物增加，通过体系中的rnasehⅱ实现相应snp位点基因型探针的切割。靶标序列存在snp位点的碱基才能触发完全配对的探针的切割。设计两条探针分别针对两个snp位点基因，探针修饰可被胶体金试纸条识别的标记，通过两条胶体金试纸条的显色情况，可判断样本中的基因型。当靶标序列存在与探针配对的snp位点基因，探针被切割，试纸条上检测线显色；当不存在配对的snp位点基因，探针不会被切割，试纸条上质控线显色，检测线不显色。

一、引物探针设计

表10rs1815739的胶体金检测(显线法)引物和探针序列

表10中181-f3、181-b3、181-fip、181-bip、181-lf和181-lb为rs1815739位点扩增引物，181-c-lfb为针对等位基因c的检测探针，181-t-lfb为针对等位基因t的检测探针。从5’到3’的顺序，下划线标记的碱基表示被修饰，其中181-c-lfb探针的5’末端修饰地高辛，g为rna碱基，3’末端修饰生物素；181-t-lfb探针的5’末端修饰地高辛，a为rna碱基，3’末端修饰生物素。

二、等温扩增反应

25μl的反应体系：20mmtris-hcl、70mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.1％tween20、1.7mmdntp、9mmmgso4、8ubst2.0warmstart、1μgrnasehii、1.6μm181-bip/181-fip、0.4μm181-lb/181-lf/181-b3/181-f3、0.2μm181-c-lfb/181-t-lfb。

反应条件：63℃，1min，40cycles(每隔1min收集荧光)

三、胶体金检测

将试纸条样本垫一端插到装有扩增产物的ep管中，使其开始层析，10min进行结果判读。

四、结果分析

结果如图10所示。通过观察分别检测样本基因型c和t探针切割情况的两条胶体金试纸条的显色，可以精确判断样本基因型。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。