一种基于DNA生物传感器的二级放大方法

本发明属于信号放大技术领域，具体涉及一种基于dna生物传感器的二级放大方法。

背景技术：

硅纳米线场效应管生物传感器利用生物分子对场效应管导电沟道电导的改变，从而使得场效应管源漏极电流发生变化，进而实现对生物分子的检测。

在针对一些疾病进行早期检测时，一方面由于实际样本(如血液)中特异性标志物的含量十分微量，对传感器的检测能力提出很大的挑战，另一方面由于环境干扰等因素的影响，硅纳米线场效应管生物传感器在进行较低浓度的目标物检测时，信号不是特别稳定。

因此，基于现有技术存在的缺陷，本发明开发了一种生物dna传感器进行二级信号放大，基于金纳米颗粒和rca滚环扩增技术，实现对传感器信号进行二级放大，进一步提高传感器的检测限和灵敏度。

技术实现要素：

基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本发明的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种基于dna生物传感器的二级放大方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于dna生物传感器的二级放大方法，包括以下步骤：

s1、将传感器表面依次用无水乙醇、去离子水冲洗并干燥，并进行氧等离子体处理，以实现对芯片表面硅烷化处理，形成末端氨基；

s2、将探针dna修饰到硅纳米线芯片上，以制得dna生物传感器；

s3、将ctdna溶液滴加至dna生物传感器表面进行杂交；

s4、将edc和nhs溶液添加到aunps溶液，以对金纳米颗粒表面活化，然后加入信号dna(spdna)和nacl溶液，通过孵育处理，以制得表面修饰有信号dna的金纳米颗粒；

s5、将表面修饰有信号dna的金纳米颗粒加入到硅纳米线芯片上，以实现一级放大；

s6、加入rca引物和模板dna，通过添加rca缓冲液，以使金纳米颗粒上的引物dna滚环扩增，以实现二级放大。

作为优选方案，所述硅纳米线为soi硅片，包括硅基底、氧化硅层和顶层硅；硅纳米线尺寸大小为50～120nm。

作为优选方案，所述s1中还包括通过戊二醛溶液浸泡，并依次进行冲洗和干燥。

作为优选方案，所述步骤s2中探针dna序列为(5’-3’)：agtgattttagagagaggattttttt-nh2’。

作为优选方案，所述步骤s3中ctdna链为(5’-3’)：atcctctctctaaaatcactaagcaggagaaagattttcta；杂交温度为室温，杂交时间不小于1小时。

作为优选方案，所述孵育处理中通过离心去除上清液，离心转速不小于10000rpm，时间不少于30min。

作为优选方案，所述信号dna(spdna)序列(5’-3’)为nh2-tttttttataccacatcatccatttttttagaaaatctttctc。

作为优选方案，所述rca引物序列(5’-3’)为tggatgatgtggtattttttttttttttttcgtgtcctcgttgtct。

作为优选方案，所述模板dna的序列(5’-3’)为gctttcgatcgttctgagcagacaacgaggacacgcttactgaatagcta。

作为优选方案，所述rca缓冲液包括1u的phi29聚合酶、0.1×的phi29聚合酶缓冲液、去离子水以及dntp。

本发明与现有技术相比，有益效果是：

1、本发明使用的rca滚环扩增技术不需要昂贵、笨重的温度循环设备，减弱了生物传感器的复杂性。

2、本发明使用的rca滚环扩增技术可以在金纳米颗粒一次放大的基础上进行二次放大，进一步提高传感器的检测限和灵敏度。

3、本发明使用的rca滚环扩增技术操作简单，且不需要针对传感器另外进行调整，可在一次信号放大不足时，再使用，实际使用中更加灵活。

4、本发明使用的rca滚环扩增技术可针对特定的dna片段进行扩增有着很好的特异性。

附图说明

图1是本发明实施例一的dna生物传感器的检测原理示意图；

图2是本发明实施例一的dna的rca滚环扩增原理示意图；

图3是本发明实施例一的二级信号放大电流响应图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。

实施例一：

本实施例提供一种基于dna生物传感器的二级放大方法，包括以下步骤：

s1、将传感器表面依次用无水乙醇、去离子水冲洗并干燥，并进行氧等离子体处理，以实现对芯片表面硅烷化处理，形成末端氨基；具体为：

首先用乙醇冲洗30s，去离子水冲洗1分钟后，氮气吹干，将纳米线表面清洗干净；接着采用氧等离子清洗机中对硅纳米线芯片进行氧等离子体处理(70w，5分钟)，以增加传感器表面的硅羟基，改善表面亲水性；然后用2％的aptes乙醇溶液浸泡过夜，这使传感器表面硅烷化，形成末端氨基；使用99.5％无水乙醇溶液冲洗多余的aptes，冲洗时间为30s，并用氮气吹干，然后放置真空干燥箱50℃烘干15分钟；之后浸泡在2.5％戊二醛溶液两小时，再用pbs溶液(1×)冲洗30s，去除多余的戊二醛，并用氮气吹干，然后放置真空干燥箱50℃烘干15分钟，此时传感器表面末端修饰上了醛基，以便与dna捕获探针共价结合。

其中，硅纳米线场效应管是(111)型soi硅片，其结构分成3层，分别为硅基底，氧化硅层和顶层硅；其上覆盖着15×8叉指结构的纳米线阵列，且纳米线尺寸大小为50～120nm。

s2、将探针dna修饰到硅纳米线芯片上，以制得dna生物传感器；具体为：

取160μl的dna捕获探针混合溶液，滴加在硅纳米线表面，孵育约2小时；之后用pbs溶液(1×)冲洗3次，除去未反应的dna捕获探针，再滴加160μl缓冲液进行静置，用keysight直流电源分析仪n6705c测量源漏极之间的电流，其中将稳定电流作为基准电流i0。

其中，探针dna序列为(5’-3’)：agtgattttagagagaggattttttt-nh2’。

s3、将ctdna溶液滴加至dna生物传感器表面进行杂交；具体为：

移除上一步的pbs溶液，在传感器表面滴加160μl的ctdna混合溶液，并于室温下杂交1h，同时用keysight直流电源分析仪n6705c观察源漏极之间的电流变化。

其中，ctdna链为(5’-3’)：atcctctctctaaaatcactaagcaggagaaagattttcta。

s4、将edc和nhs溶液添加到aunps溶液，以对金纳米颗粒表面活化，然后加入信号dna(spdna)和nacl溶液，以制得表面修饰有信号dna的金纳米颗粒；具体为：

取2nm2ml的aunps溶液，添加1ml3.2mm的edc和1ml0.8mm的nhs，常温活化30分钟，以激活末端修饰的羧基；加入20um20ul的信号dna(spdna)，进行室温震荡孵育，孵育时间16小时；之后，缓慢逐滴加入0.5mol/lnacl溶液，分5次滴加，每次滴加200ul，间隔1小时，并且充分混匀，nacl的最终浓度在0.1mol/l；继续室温孵育24h，最终形成co＝nh键，成功修饰信号dna(spdna)，其中，整个孵育过程需要遮光处理，以防止金纳米颗粒发生团聚；以10000rpm离心30min去除多余试剂，去除上清液，并最终分散在3ml10mmol/l的pbs磷酸盐缓冲液(137mm的nacl，2.7mm的kcl，10mm的磷酸盐，ph为7.2～7.4)中，并于4℃遮光保存。

其中，信号dna(spdna)序列(5’-3’)为nh2-tttttttataccacatcatccatttttttagaaaatctttctc。

s5、将表面修饰有信号dna的金纳米颗粒加入到硅纳米线芯片上，以实现一级放大；具体为：

先将160μl的aunps/spdna复合物滴加在硅纳米线表面，孵育1小时，吸走硅纳米线表面的溶液，并检测电流变化。

s6、加入rca引物和模板dna，通过添加rca缓冲液，以使金纳米颗粒上的引物dna滚环扩增，以实现二级放大；具体为：

取160μl杂交缓冲液(1μm的rca引物，1μm的rca环状模板和0.1×的pbs溶液以体积比为1:1:98混合)滴在硅纳米线芯片上。

其中，rca引物序列(5’-3’)为tggatgatgtggtattttttttttttttttcgtgtcctcgttgtct；模板dna的序列(5’-3’)gctttcgatcgttctgagcagacaacgaggacacgcttactgaatagcta。

滴加160μl的rca缓冲液(1u的phi29聚合酶，0.1×的phi29聚合酶缓冲液，0.1％的去离子水以及0.1mm的dntp混合形成)，监测电流变化。

本实施例的探针dna溶液配置的方法为：将探针dna链干粉于离心机中以5000rpm高速离心1min，再用0.01mol的pbs缓冲溶液，ph＝7.4配置成浓度为2.5μm的探针dna溶液，于混匀器混匀30～60s。

如图1所示，搭建dna生物传感器定量检测特定dna的平台，以硅纳米线为传输通道。在硅纳米线上以硅烷剂aptes作为连接物，将dna探针以肽键的形式固定在纳米线表面。引入目标ctdna后，通过碱基互补配对原则进行杂交以定量检测dna。

如图2所示，进行dna的rca滚环扩增，在硅纳米线上滴加制备好的aunps/spdna复合物，使得硅纳米线上的探针dna捕获金纳米颗粒。孵育结束后，加入杂交缓冲液杂交10～15分钟，环形dna模板通过引物和金纳米颗粒上的信号dna相连接，吸走硅纳米线上的溶液，再加入rca缓冲液，在phi29dna聚合酶的作用下，dntp作为合成原料合成dna，使得金纳米颗粒上引物dna延长，rca滚环扩增使得金纳米颗粒表面的引物dna延长使得硅纳米线表面的负电荷大量聚集，从而造成硅纳米线的栅极负电势增大，硅纳米线中的载流子变化，进而导致电流的增大，实现信号的二级放大。

如图3所示，dna生物传感器检测ctdna的结果，加入aunps/spdna后电流响应信号有了一个明显的上升，实现了一级放大。在加入rcatemplate(rca环状模板)和引物之后，电流响应有一个小幅度的下降，之后加入rca缓冲液进行扩增，电流响应上升，即实现了对信号的二级放大。

本实施例使用的rca滚环扩增技术不需要昂贵、笨重的温度循环设备，减弱了生物传感器的复杂性；rca滚环扩增技术可以在金纳米颗粒一次放大的基础上进行二次放大，进一步提高传感器的检测限和灵敏度；rca滚环扩增技术操作简单，且不需要针对传感器另外进行调整，可在一次信号放大不足时，再使用，实际使用中更加灵活；rca滚环扩增技术可针对特定的dna片段进行扩增有着很好的特异性。

以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。