一种聚集诱导发光肽组装体、制备、检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物医学工程材料领域，更具体地，涉及一种聚集诱导发光肽组装体、制备、检测方法及其应用。

背景技术：

内毒素是革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释放出的毒素。内毒素不是蛋白质，因此非常耐热，在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。

当病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素败血症。例如青霉素问世之际，医生曾用大剂量青霉素治疗奈瑟菌属引起的重症脑膜炎患者，在杀灭致病菌的同时，导致被杀灭的致病菌崩解后释放了大量的内毒素进入血液，导致器官衰竭，从而引发了内毒素休克而患者死亡。据文献报道，在美国每年约有70万名患者由细菌内毒素而引起的一系列医学健康问题，并造成约25万人的死亡(expertrev.anti-infect.ther.2011,9,507-520)。同时，在欧洲内毒素败血症成为医院患者死亡的主要原因之一，约占总死亡率30％～50％(brjmedpract,2008,1,7-12)。研究表明，注射、透析和饮用水污染也可能导致内毒素感染，例如透析患者每年通常使用2～3w升透析液，然而透析液由于内毒素的污染而导致感染炎症的风险大大增加(anal.biochem.2015,470,71-77)。考虑到内毒素对临床患者的健康具有重大的威胁，因此，临床注射液中内毒素的检测尤为必要。

目前市面上关于内毒素检测方法，使用较多的是酶裂解法。然而该方法测定结果易受温度、ph和样品中各种干扰因素的影响，且测试步骤繁琐，样品储备量大，受控条件较多(pdaj.pharm.sci.technol.2012,66,542-546)，而且无法满足次纳摩尔甚至皮摩尔状态下的细菌内毒素检测要求。因此，特异性、灵敏、方便的细菌内毒素传感器的开发变得至关重要。最早关于内毒素检测传感器的报道是基于功能化的聚乙炔脂质体，然而只能检测到100μm以上的高浓度内毒素样品(j.am.chem.soc.2004,126,5038-5039)。近年来基于金纳米粒子(nanores.2012,5,486-493)和聚噻吩型(j.am.chem.soc.2012,134,6685-6694)的内毒素传感器被提出，使其检测极限显著提高至低纳摩尔水平。然而，这些传感器依然不够稳定和灵敏，无法满足次纳摩尔甚至皮摩尔状态下的细菌内毒素检测要求。

技术实现要素：

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种聚集诱导发光肽组装体、制备、检测方法及其应用，将具有聚集诱导发光效应的肽组装材料作为细菌内毒素检测的荧光开启传感器，设计思路新颖，其对细菌内毒素具有特异性和较高灵敏度，提高了对细菌内毒素的检测极限，且检测过程简单，测试结果稳定。

本发明采取的技术方案是，

一种聚集诱导发光肽组装体，包括黑磷纳米片和聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽，所述黑磷纳米片表面包覆聚多巴胺，在溶液状态下，所述聚集荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽通过π-π共轭的静电相互作用堆叠于所述黑磷纳米片表面。

在本技术方案中，黑磷纳米片具有优异的表面活性、可调谐的带隙、高的载流子迁移率、温和的开/关比率、良好的生物相容性及生物降解性等特性，且其具有显着的光稳定性和相对的ph耐受性，显示出很高的荧光效率；在生物成像中，大多荧光染料被设计成在特定的细胞器中积累，但传统的染料如果在特定位置积累太多，将会因浓度猝灭效应导致荧光猝灭，而聚集诱导发光(aie)效应具有无自猝灭、良好的光稳定性和对分析物的光响应等优势，具有aie特性的发光剂(aiegens)性能优越，体现为高亮度、聚集态的光稳定性和分子溶解态的低荧光性，甚至当大量aiegens聚集时，能产生耐光漂白的增强荧光，将其与能够特异性结合细菌内毒素的多肽连接起来，修饰后的多肽可与细菌内毒素结合，并通过荧光呈现细菌内毒素的浓度，甚至，可改变靶向肽类型，实现其他毒素、生物标志物甚至是致病菌的检测。

因此，采用表面包覆聚多巴胺的黑磷纳米片，可与聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽产生π-π共轭的静电相互作用，使其大量堆叠形成产生荧光信号，进而实现荧光强度与细菌内毒素含量的呈负相关关系。当检测样品存在细菌内毒素时，细菌靶向肽脱离黑磷纳米片与细菌内毒素结合，这种靶标与受体的竞争性结合作用，使荧光呈线性减弱，这种反向荧光检测方式与现有的荧光强度与细菌内毒素浓度呈正相关的正向荧光检测方式相比，其荧光强度变化更加显著，使得该肽组装体作为荧光传感器时，其检测最低极限可达至次纳摩尔甚至皮摩尔水平，当样品中存在高浓度级别的细菌内毒素时，荧光的变化甚至可以通过肉眼直接观察到，且该测试结果稳定，不易受样品温度、ph等其他干扰因素影响，也不会因检测时间过短或过长而导致检测结果不准确。

优选地，所述聚集诱导荧光分子为四苯乙烯衍生物。

更优选地，所述四苯乙烯衍生物为四羧基四苯乙烯(tpe-(cooh)4)。

在本技术方案中，四苯乙烯及其衍生物属于具有aiegens的一种，能发生aie效应，具有出色的aie特性，此外，四苯乙烯及其衍生物还可以通过苯环共轭骨架和易修饰的离子官能团结构，轻松实现自组装和电荷转化，使修饰制备肽组装体操作更为简单。

一种聚集诱导发光肽组装体的制备方法，包括以下步骤：

s1制备聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，具体步骤为：

a1将块状黑磷充分分散于无水1-甲基-2-吡咯烷酮中，于15～25℃中进行超声破碎6～9h后以2000～4000rpm的转速离心20～30min，收集棕色上清液；

a2将步骤a1制得的棕色上清液以9000～12000rpm的转速离心15～30min离心得片状黑磷沉淀，冷冻干燥所述片状黑磷沉淀后将其进行超声分散0.5～1h以均匀分散于无水乙醇中，加入盐酸多巴胺水溶液和氢氧化钠水溶液，避光搅拌2～5h后，进行离心并用纯水多次洗涤，冷冻干燥得聚多巴胺包覆的黑磷纳米片；

s2聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽制备：取四苯乙烯衍生物溶解于pbs磷酸盐缓冲溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌3～5h加入细菌内毒素靶向肽反应10～15h，避光透析后冷冻干燥得四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽；

s3肽组装体制备：将步骤s2制得的四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽溶解于pbs磷酸盐缓冲溶液，加入步骤s1制得的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，搅拌0.25～1h得处于溶液状态下的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽组装于聚多巴胺包覆的黑磷纳米片的肽组装体。

优选地，在步骤a1中，所述块状黑磷分散于无水1-甲基-2-吡咯烷酮溶液的质量分数为0.25～0.5mg/ml。

优选地，在步骤a2中，所述冷冻干燥的片状黑磷沉淀与加入的所述盐酸多巴胺的质量比为1:1～2，所述盐酸多巴胺水溶液与所述氢氧化钠水溶液的浓度比为1:1～2。

优选地，在步骤s2中，所述四苯乙烯衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和细菌内毒素靶向肽的摩尔比为1:1～4:1～4:1～4。

优选地，在步骤s2中，透析截留的分子量为1000～2000da。

优选地，在步骤s3中，所述步骤s2制得的四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽溶解于pbs磷酸盐缓冲溶液的浓度为1～5μm，所述四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽浓度与加入的所述聚多巴胺包覆的黑磷纳米片质量之比为1μm:25～50μg。

优选地，在步骤a1中，所述超声破碎采用650w超声波破碎仪，且所述超声波破碎仪设定单次超声时间为10s，单次间隙时间为5s。

优选地，所述步骤s1、s2、s3均在室温下进行，所述室温为5～40℃。

优选地，所述步骤a2中，采用的无水乙醇的制备方法为：向每500ml乙醇中加入1～2g氢化钙，搅拌干燥6～24h后，常压蒸馏得无水乙醇。

在本技术方案中，将细胞内毒素靶向肽和四苯乙烯衍生物键合，形成四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽，在溶液状态下通过π-π共轭与聚多巴胺包覆的黑磷纳米片发生静电相互作用，形成肽组装体作为聚集诱导发光肽组装体荧光传感器，与其他检测试剂相比，本制备方法更为简单，且细胞靶向肽为人工合成的多肽序列，技术成熟，获取周期短，更易于制备。

此外，在本技术方案中，这种靶向肽结合触发的释放策略与aie相结合，为构建蛋白质、dna和适配体等生物分子检测平台提供良好的研究思路，可以通过改变靶向肽类型，选择能与其他其他毒素、生物标志物甚至是致病菌结合的靶向肽，实现这些物质的检测。

一种细菌内毒素的检测方法，利用上述的聚集诱导发光肽组装体或上述的方法制备的聚集诱导发光肽组装体作为荧光传感器，检测细菌内毒素，具体包括以下步骤：

l1所述聚集荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽堆叠于所述黑磷纳米片表面产生荧光信号，荧光传感器处于开启状态；

l2所述聚集诱导发光肽组装体与检测样品混合，聚集荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽挣脱静电相互作用与检测样品内的细菌内毒素竞争性结合；

l3聚集荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽与检测样品内的细菌内毒素结合，不断脱离黑磷纳米片表面，荧光信号逐渐减弱，荧光传感器处于关闭状态。

在本技术方案中，使用所述聚集诱导发光肽组装体作为荧光传感器检测细胞内毒素时，操作过程简单，不需添加多余试剂物，检测过程中不易产生大量的医疗废物，且较为环保节能，利用了对内毒素的特异性及灵敏度高的细胞内毒素靶向肽与内毒素特异性的靶标与受体竞争性结合作用，使荧光传感器的荧光强度与内毒素浓度呈负相关关系，并将荧光强度的变化作为信号分子对检测样品中细菌内毒素的含量进行测定，使得对样品中细菌内毒素浓度的检测极限提高至次纳摩尔甚至皮摩尔水平，而聚集荧光分子无自猝灭，光稳定性良好，可排除温度、反应时间、反应温度等众多因素干扰，使检测结果更为稳定。

上述聚集诱导发光肽组装体荧光传感器或上述制备方法在细菌内毒素和革兰氏阴性菌活菌检测的应用。

本技术方案中，在溶液状态下的聚集诱导发光肽组装体可作为临床常用注射液(包括生理盐水、血液、白蛋白注射液、胰岛素等常见注射液)中的细菌内毒素荧光传感器，用于检测试剂盒、指示剂等产品，具有良好的市场转化前景，此外，由于细菌内毒素主要存在于革兰氏阴性菌外膜表面，一些检测方法仅针对细菌内毒素的检测，而无法检测到革兰氏阴性菌，本发明的聚集诱导发光肽组装体进行了功能性扩展，可用于检测革兰氏阴性菌活菌，对于细菌内毒素检测至关重要。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明通过靶向肽结合触发的释放策略与聚集诱导发光效应相结合，为构建蛋白质、dna和适配体等生物分子检测平台提供良好的研究思路，可以通过改变靶向肽类型，选择能与其他其他毒素、生物标志物甚至是致病菌结合的靶向肽，实现这些物质的检测；

(2)与传统的酶裂解法检测细菌内毒素相比，本发明采用荧光强度的变化作为信号分子对检测样品中细菌内毒素的含量进行测定，检测过程简单，测试结果稳定且不易受样品温度、ph等其他干扰因素影响；

(3)本发明的聚集诱导发光肽组装体作为荧光传感器时，检测最低极限可达至次纳摩尔甚至皮摩尔水平，当样品中存在高浓度级别的细菌内毒素时，荧光的变化甚至可以通过肉眼直接观察到，且该测试结果稳定；

(4)本发明的聚集诱导发光肽组装体制备方法步骤简单，采用容易获取的细胞靶向肽，且用到的其余试剂均易于制备，使肽组装体制备更为容易；

(5)本发明的聚集诱导发光肽组装体可作为临床常用注射液中的细菌内毒素荧光传感器，用于检测试剂盒、指示剂等产品，具有良好的市场转化前景，还对荧光传感器进行了功能性扩展，使其能用于检测革兰氏阴性菌活菌，扩大了检测种类，对细菌内毒素检测起到至关重要的作用。

附图说明

图1为高倍透射电镜观察黑磷纳米片及聚多巴胺包覆的黑磷纳米片形貌变化。

图2为四苯乙烯衍生物、细菌内毒素靶向肽以及四苯乙烯衍生物修饰的细菌内毒素靶向肽的近红外光谱分析。

图3为聚集诱导发光肽组装体在不同浓度的细菌内毒素溶液中的荧光滴定光谱及荧光强度变化校准曲线。

图4为聚集诱导发光肽组装体和聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽在浓度为10nm的细菌内毒素溶液中的荧光灵敏度比较图。

图5为聚集诱导发光肽组装体在含有不同干扰物的同等浓度的细菌内毒素溶液中的相对荧光强度比较图。

图6为聚集诱导发光肽组装体对不同种革兰氏阴性菌检测的相对荧光强度比较图。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

以下实施例所述无水乙醇的制备方法按照以下操作步骤：向每500ml乙醇中加入1～2g氢化钙，搅拌干燥6～24h后，常压蒸馏得无水乙醇。

以下实施例所述无水1-甲基-2-吡咯烷酮购自于上海阿拉丁试剂有限公司，纯度为99.5％。

以下实施例所述超声破碎仪为宁波新芝生物科技股份有限公司，型号为jy92-iidn。

以下实施例所述四苯乙烯衍生物为四羧基四苯乙烯(tpe-(cooh)4)，购自于西安瑞禧生物科技有限公司，纯度为99％。

以下实施例所述细菌内毒素靶向肽购自于上海吉尔生化有限公司，序列为kknysssissihcrkrkrk-nh2，纯度＞98％。

以下实施例所述pbs磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01m，ph为7.4。

实施例1

本实施例提供一种聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，制备的具体步骤为：

a1将块状黑磷置于20ml无水1-甲基-2-吡咯烷酮中，超声0.5h至充分分散，置于冰水浴中将温度维持在15℃下并采用650w超声破碎仪进行超声破碎6h，设定单次超声时间为10s，单次间隙时间为5s，然后以2000rpm的转速离心20min去除未剥落的黑磷颗粒，收集棕色上清液，并低温保存；

a2将步骤a1制得的棕色上清液以9000rpm的转速离心15min离心去除1-甲基-2-吡咯烷酮，收集剥落后的片状黑磷沉淀，冷冻干燥所述片状黑磷沉淀后将其超声分散0.5～1h以均匀分散于5ml无水乙醇中，分别加入10μl盐酸多巴胺水溶液和10μl氢氧化钠水溶液，避光搅拌2h后，进行离心并用纯水多次洗涤，冷冻干燥得聚多巴胺包覆的黑磷纳米片。

在步骤a1中，分散于无水1-甲基-2-吡咯烷酮的块状黑磷的质量分数为0.25mg/ml；

在步骤a2中，冷冻干燥后的片状黑磷沉淀与加入的盐酸多巴胺的质量比为1:1，加入的盐酸多巴胺水溶液和氢氧化钠水溶液浓度为1:1。

实施例2

本实施例提供一种聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，制备的具体步骤为：

a1将块状黑磷置于20ml无水1-甲基-2-吡咯烷酮中，超声1h至充分分散，置于冰水浴中将温度维持在25℃下并采用650w超声破碎仪进行超声破碎9h，设定单次超声时间为10s，单次间隙时间为5s，然后以4000rpm的转速离心30min去除未剥落的黑磷颗粒，收集棕色上清液，并低温保存；

a2将步骤a1制得的棕色上清液以12000rpm的转速离心30min离心去除1-甲基-2-吡咯烷酮，收集剥落后的片状黑磷沉淀，冷冻干燥所述片状黑磷沉淀后将其超声分散1h以均匀分散于10ml无水乙醇中，分别加入50μl盐酸多巴胺水溶液和50μl氢氧化钠水溶液，避光搅拌5h后，进行离心并用纯水多次洗涤，冷冻干燥得聚多巴胺包覆的黑磷纳米片。

在步骤a1中，分散于无水1-甲基-2-吡咯烷酮的块状黑磷的质量分数为0.5mg/ml；

在步骤a2中，冷冻干燥后的片状黑磷沉淀与加入的盐酸多巴胺的质量比为1:2，加入的盐酸多巴胺水溶液和氢氧化钠水溶液浓度为1:2。

实施例3

本实施例提供一种聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽，制备的具体步骤为：

在室温下取一定质量的四苯乙烯衍生物溶解于5～10mlpbs磷酸盐缓冲溶液中，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌3～5h加入细菌内毒素靶向肽反应10～15h，避光采用透析袋透析后冷冻干燥得四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽。

所述四苯乙烯衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和细菌内毒素靶向肽的摩尔比为1:2:2:2；所述透析袋截留的分子量为1000～2000da。

实施例4

本实施例提供一种聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽，制备的具体步骤为：

在室温下取一定质量的四苯乙烯衍生物溶解于5～10mlpbs磷酸盐缓冲溶液中，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌3～5h加入细菌内毒素靶向肽反应10～15h，避光采用透析袋透析后冷冻干燥得四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽。

所述四苯乙烯衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和细菌内毒素靶向肽的摩尔比为1:4:4:4；所述透析袋截留的分子量为2000da。

实施例5

本实施例提供一种聚集诱导发光肽组装体，采用实施例3的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片和实施例1的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽进行制备，具体步骤为：

将实施例3制得的四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽溶解于10mlpbs磷酸盐缓冲溶液，加入实施例1制得的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，搅拌0.25～1h得处于溶液状态下的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽组装于聚多巴胺包覆的黑磷纳米片的肽组装体。

在本实施例中，所述四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽的浓度为1μm，所述四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽浓度与加入的所述聚多巴胺包覆的黑磷纳米片质量之比为1μm:25μg。

实施例6

本实施例提供一种聚集诱导发光肽组装体，采用实施例3的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片和实施例1的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽进行制备，具体步骤为：

将实施例3制得的四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽溶解于10mlpbs磷酸盐缓冲溶液，加入实施例1制得的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，搅拌0.25～1h得处于溶液状态下的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽组装于聚多巴胺包覆的黑磷纳米片的肽组装体。

在本实施例中，所述四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽的浓度为5μm，所述四苯乙烯修饰的细菌内毒素靶向肽浓度与加入的所述聚多巴胺包覆的黑磷纳米片质量之比为1μm:50μg。

实施例7

本实施例为对制备的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片进行测定，具体测定方法为：

称取2mg实施例1的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片(bp@pda)分散于1ml纯水中，取200μl分散液缓慢滴加到高倍透射电镜专用铜网上，自然干燥后使用高倍透射电镜观察，同时使用马尔文粒度仪测定其粒径大小。

称取2mg普通黑磷纳米片(bpnss)并采用上述同样的方法进行测定。

测试结果如图1所示，其中图1a为普通黑磷纳米片在高倍透射电镜下显示的形貌，图1b为聚多巴胺包覆的黑磷纳米片在高倍透射电镜下显示的形貌，图1c为普通黑磷纳米片在马尔文粒度仪测定的粒径大小，图1d为聚多巴胺包覆的黑磷纳米片马尔文粒度仪测定的粒径大小。

将图1b与图1a比较，可见图1b的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片比起图1a的普通黑磷纳米片，其表面具有一层致密的pda涂层。由图1c可见，普通黑磷纳米片的平均粒径仅为260.1nm，粒径分散度pdi为0.333，而由图1d可见，聚多巴胺包覆的黑磷纳米片的平均粒径为480nm，粒径分散度pdi为0.445，二者对比可知实施例1的聚多巴胺包覆的黑磷纳米片粒径明显增大，分散度更小，表明已成功制备聚多巴胺包覆的黑磷纳米片。

实施例8

本实施例对制备的四苯乙烯衍生物修饰的细菌内毒素靶向肽进行测定，具体测定方法为：

将实施例3制得的四苯乙烯衍生物修饰的细菌内毒素靶向肽(tpe-peptide)、四苯乙烯衍生物(tpe衍生物)和细菌内毒素靶向肽分别通过溴化钾压片法进行红外光谱表征。

表征测定结果如图2所示，tpe-peptide与tpe衍生物同时出现了在650cm^-1～900cm^-1处的苯环特征吸收峰，以及内毒素靶向肽在1642cm^-1和1550cm^-1处的强酰胺基特征吸收峰，说明tpe衍生物和细菌内毒素靶向肽成功反应，最终得到四苯乙烯衍生物修饰的细菌内毒素靶向肽。

实施例9

本实施例对作为荧光传感器的聚集诱导发光肽组装体在检测细菌内毒素时的有效性进行验证，具体验证的实验方法为：

将实施例6的在溶液状态下的聚集诱导发光肽组装体与0～10μm不同浓度的细菌内毒素水溶液混合后，在360nm的激发波照射下，利用荧光分光光度计测定其荧光强度，当聚集诱导发光效应减弱，则判定其能有效检测到细菌内毒素。

验证的实验结果如图3所示，图3a为在不同浓度的细菌内毒素水溶液下聚集诱导发光肽组装体的荧光滴定光谱，图3b为在不同浓度的细菌内毒素水溶液下聚集诱导发光肽组装体荧光变化校准曲线，其中，f0为没有细菌内毒素条件下荧光传感器在495nm处荧光强度，f是不同浓度的细菌内毒素存在时荧光传感器的荧光强度，f/f0代表不同浓度细菌内毒素存在时荧光传感器的相对荧光强度。

如图3a所示，当未加入细菌内毒素时，荧光传感器的荧光强度最大，因此时没有细菌内毒素存在，聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽通过π-π共轭与聚多巴胺包覆的黑磷纳米片发生静电相互作用而大量聚集，产生聚集诱导发光效应而具有强烈的荧光；当向荧光传感器加入的细菌内毒素水溶液浓度逐渐增加，大量聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽与细菌内毒素结合，发生竞争性相互反应，从而使修饰的细菌内毒素靶向肽不断地从聚多巴胺包覆的黑磷纳米片表面脱离，聚集诱导发光效应相应减弱，荧光强度逐渐减小；当加入的细菌内毒素浓度增加到10μm时，荧光传感器的荧光强度最弱。

图3b为根据加入的细菌内毒素溶液浓度与荧光传感器的荧光强度的线性关系绘制标准曲线，其r²相关系数为＝0.99847，可见，细菌内毒素浓度与荧光传感器的相对荧光强度呈负相关关系，随着细菌内毒素浓度上升，荧光传感器的相对荧光强度相应稳定下降。

此外，从实验过程中，还发现发现该传感器在3min内荧光强度达到饱和状态，比传统的酶裂解法的测定时长(约1h)要快数倍左右，同时该传感器在25℃的温度下依然保持稳定状态，无需特殊存储和严格的温度要求，检测时间短，测试的结果更为稳定。

实施例10

本实施例对作为荧光传感器的聚集诱导发光肽组装体在低浓度的细菌内毒素下的检测效果进行验证，具体验证的实验方法为：

将实施例6的在溶液状态下的聚集诱导发光肽组装体和实施例4的聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽溶液浓度调节至一致，分别与浓度为10nm的细菌内毒素溶液混合，在360nm的激发波照射下，利用荧光分光光度计分别测定实施例6和实施例4的溶液混合细菌内毒素前后的荧光强度变化。

验证的实验结果如图4所示，其中，f0为没有细菌内毒素条件下荧光传感器或修饰后的靶向肽在495nm处荧光强度，f是细菌内毒素存在时荧光传感器或修饰后的靶向肽的荧光强度，f/f0代表不同浓度细菌内毒素存在时荧光传感器或修饰后的靶向肽的相对荧光强度，所有数据均以平均值±标准差方式呈现，使用graphpad软件(inc.,lajolla,ca,usa)中的onewayanova方法对实验组之间差异进行分析。实验结果的显著值根据p值确定，其中***p＜0.001时，代表具有显著性差异。

如图4所示，在浓度为10nm的细菌内毒素加入前后，聚集诱导发光肽组装体(tpe-peptide/bp@pda)的相对荧光强度约为1.0和0.9，且显著性为***p，表明其荧光强度在细菌内毒素加入前后具有显著性的变化；聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽(tpe-peptide)在浓度为10nm的细菌内毒素加入前后的荧光强度较弱且无明显变化，

由上述实验结果可知，实施例6的聚集诱导发光肽组装体可用于检测低浓度的细菌内毒素，且变化明显，易于检测，其原因在于，聚集诱导发光肽组装体是聚集诱导荧光分子修饰的细菌内毒素靶向肽通过π-π共轭的静电作用堆叠于聚多巴胺包覆的黑磷纳米片，在加入细菌内毒素前显示较强的荧光强度，在加入细菌内毒素后，靶向肽脱离黑磷纳米片并与之结合，使荧光强度变弱，从而实现荧光强度与细菌内毒素含量呈现负反馈的反向比例，且能荧光强度变化显著。所以，荧光传感器的聚集诱导发光肽组装体在聚多巴胺包覆的黑磷纳米片存在条件下，荧光强度与细菌内毒素含量呈负相关关系，这样的检测原理对于存在低浓度细菌内毒素的试剂而言具有重要的应用前景。

实施例11

本实施例对作为荧光传感器的聚集诱导发光肽组装体抗干扰物影响效果进行评估，选用水、乙二胺四乙酸、柠檬酸盐、葡萄糖、牛血清蛋白和磷酸盐等对传统酶解法测定内毒素有影响的干扰物，具体评估的实验方法为：

将上述6种干扰物分别与相同浓度的细菌内毒素溶液混合后分别加入实施例5在溶液状态下的聚集诱导发光肽组装体后，利用荧光分光光度计测定其在495nm处的荧光强度。同时，设置只有加入干扰物的样品作为对照组，对照组为向实施例5在溶液状态下的聚集诱导发光肽组装体加入上述浓度相同的干扰物，并同样用荧光分光光度计测定其在495nm处的荧光强度。

评估的实验结果如图5所示，其中，f0为没有细菌内毒素条件下荧光传感器在495nm处荧光强度，f是细菌内毒素存在时荧光传感器的荧光强度，f0/f是细菌内毒素存在时荧光传感器的相对荧光强度。

由图5可知，只加入了干扰物的对照组相对荧光强度较弱，相比之下，加入了干扰物和细菌内毒素的样品相对荧光强度显著增加，荧光强度并未受到干扰物存在而受到影响。可见，即使在使用本发明的荧光传感器检测时，即使存在潜在的干扰物，其对细菌内毒素依然有很高的选择性，测试效果仍能保持稳定且良好。

实施例12

虽然上述实施例验证了本发明的聚集诱导发光肽组装体可作为荧光传感器检测细菌内毒素，但是细菌内毒素主要存在于革兰氏阴性菌外膜表面，因此本实施例进一步扩大评估所述荧光传感器对革兰氏阴性菌活菌的检测性能。

本实施例中用于检测的革兰氏阴性菌均为购自于广东省微生物菌种保藏中心的克雷白杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和沙门氏杆菌。

具体检测的实验方法为：

在37℃下将上述菌种分别培养至生长对数期，离心去除培养基后，稀释定量至1.0×10⁴cfu/ml以获得菌悬液，分别取100μl菌悬液稀释至2ml后加入实施例5所制得的聚集诱导发光肽组装体孵育1min，在360nm的激发波照射下，利用荧光分光光度计测定其在495nm处的荧光强度，该荧光强度记为f1。

检测的实验结果如图6所示，其中，f0为没有细菌内毒素条件下荧光传感器在495nm处荧光强度，f0/f1为各种革兰氏阴性细菌存在时的相对荧光强度。

根据图6可以看出，加入革兰氏阴性菌后，荧光传感器的相对荧光强度显著增加，该实验结果表明了本发明的聚集诱导发光肽组装体可作为荧光传感器检测多种革兰氏阴性菌的存在，这一功能性扩展优势对于内毒素检测至关重要。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。