一种玉米耐盐基因及其应用

1.本发明属于分子育种生物学技术领域，具体涉及一种盐响应的玉米功能基因及其应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是禾本科的一年生草本植物，是世界重要的粮食作物。玉米中的维生素含量非常高，是稻米、小麦的5
‑
10倍，在所有主食中，玉米的营养价值和保健作用是最高的。玉米中含有的核黄素等高营养物质，对人体是十分有益的。
3.我国有大面积的盐碱地，玉米在这些盐碱地上生长，产量很低，开发耐盐品种的玉米，一直是研究的热点课题。从基因改造的角度改善玉米的耐盐特性，研究的最为广泛，已报道的耐盐相关基因有：zmnac89、ppase、cipk42、zmknolle等。开发新的耐盐基因，从而为耐盐玉米品种的选育打下基础，仍然具有重大意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种玉米耐盐基因及其应用。
5.本发明以耐盐(nx487)与盐敏感(nx420)自交系构建f2群体，以f2群体为研究对象，进行bsa分析，结果获得一个候选基因zmbsn1。
6.一种玉米耐盐基因，所述耐盐基因为zmbsn1，其核苷酸序列如序列表seq id no：1所示。
7.所述耐盐基因表达的蛋白序列如序列表seq id no：2所示。
8.一种所述玉米耐盐基因的载体。
9.含有所述玉米耐盐基因载体的重组菌或细胞系。
10.扩增所述的玉米耐盐基因中任一片段的引物。
11.所述玉米耐盐基因在提高植物耐盐方面的应用。
12.本发明的有益效果：本发明以耐盐(nx487)与盐敏感(nx420)自交系构建f2群体，以f2群体为研究对象，进行bsa分析，获得一个耐盐基因zmbsn1，该耐盐基因与na
+
的转运高度相关。为选育高耐盐玉米品种打下了良好的理论基础。
附图说明
13.图1为耐盐(nx487)与盐敏感(nx420)植株在正常培养和盐胁迫下的表型。
14.图2为耐盐(nx487)与盐敏感(nx420)植株na
+
、k
+
含量测定。
15.图3为定位基因zmbsn1的qrt
‑
pcr分析。
16.图4为载体连接方案。
17.图5为载体结构示意图。
18.图6为基因编辑突变体表型分析。
19.图7为基因编辑突变体离子分析。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
21.实施例1
22.以耐盐(nx487)与盐敏感(nx420)自交系构建f2群体，以f2群体为研究对象(图1)，进行bsa分析，结果获得一个候选基因zmbsn1。
23.所述耐盐基因被命名为zmbsn1，其核苷酸序列如序列表seq id no：1所示。所述耐盐基因表达的蛋白序列如序列表seq id no：2所示。
24.实施例2盐胁迫下亲本体内na
+
、k
+
含量测定分析
25.测定方法：称取样品，于50ml消解罐中，加硝酸：高氯酸＝5：1混合酸10ml，浸泡3
‑
4小时，然后置于石墨消解炉上消化(注意一定不要烧干)如酸量过少，可补加适当的混合酸液，继续消化至无色透明，待有大量白烟冒净时，液体接近1
‑
2ml时，取下冷却，用去离子水定容至25ml具塞试管中，摇匀备用，同时做试剂空白。采用火焰光度计上机测定。
26.对亲本材料在200mm nacl胁迫14天后取其根、叶进行na
+
、k
+
含量测定，结果显示，抗性亲本nx487的根、叶中na
+
、k
+
含量明显高于敏感亲本nx420，同时对其k
+
：na
+
进行分析，抗性亲本nx487的k
+
：na
+
明显高于敏感亲本nx420。结果见图2。
27.实施例3定位基因zmbsn1的表达分析
28.对亲本材料在200mm nacl胁迫14天后取其根、叶，提取rna，进行qrt
‑
pcr，结果显示，在高盐胁迫下，敏感亲本nx420根部zmbsn1表达量明显高于抗性亲本，高出近3倍，结果见图3。
29.实施例4基因编辑突变体表型分析
30.玉米基因敲除载体780构建：对zmbsn1基因进行crispr敲除，设计三个靶点，构建编辑载体，构建过程如下：
31.一、预选靶标
32.t1：gactggagccggagtcgccg
33.t2：ggcgccaactacatcagccg
34.t3：ggctgctgttgccggcgccg
35.二、构建中间载体
36.1、引物合成
37.780
‑
t1引物：
38.780
‑
t1+:cagtggtctcaggca gactggagccggagtcgccg
39.780
‑
t1
‑
:cagtggtctcaaaac cggcgactccggctccagtc
40.780
‑
t2引物：
41.780
‑
t2+:cagtggtctcagccg ggcgccaactacatcagccg
42.780
‑
t2
‑
:cagtggtctcaaaac cggctgatgtagttggcgcc
43.780
‑
t3引物：
44.780
‑
t3+:cagtggtctcaatgt ggctgctgttgccggcgccg
45.780
‑
t3
‑
:cagtggtctcaaaac cggcgccggcaacagcagcc
46.2、引物变性、退火，得到grna片段
47.h20:40ul
48.(1)pcr体系50ul正向引物：5ul
49.反向引物：5ul
50.(2)pcr程序：
51.pcr反应参数设置：
[0052][0053][0054]
3、酶切连接
[0055]
(1)780
‑
t1:
[0056]
grna片段：2ul
[0057]
空载1：1.5ul
[0058]
酶切连接体系eco31i：0.5ul
[0059]
(10ul)t4
‑
ligase：0.5ul
[0060]
t4
‑
buffer：1ul
[0061]
h2o：4.5ul
[0062]
把配置好的体系置于37℃培养箱2h
[0063]
(2)780
‑
t2:
[0064]
grna片段：2ul
[0065]
空载2：1.5ul
[0066]
酶切连接体系eco31i：0.5ul
[0067]
(10ul)t4
‑
ligase：0.5ul
[0068]
t4
‑
buffer：1ul
[0069]
h2o：4.5ul
[0070]
把配置好的体系置于37℃培养箱约2h左右
[0071]
(3)780
‑
t3:
[0072]
grna片段：2ul
[0073]
空载3：1.5ul
[0074]
酶切连接体系eco31i：0.5ul
[0075]
(10ul)t4
‑
ligase：0.5ul
[0076]
t4
‑
buffer：1ul
[0077]
h2o：4.5ul
[0078]
把配置好的体系置于37℃培养箱约2h左右
[0079]
4、重组质粒转化
[0080]
(1)取一管200μl大肠杆菌感受态细胞dh5a与5μl连接产物混合，冰浴30min；
[0081]
(2)迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；
[0082]
(3)加入500μl lb液体培养基，混匀；
[0083]
(4)37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；
[0084]
(5)将菌液均匀涂布于lb固体培养基平板上；
[0085]
(6)30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。
[0086]
5、阳性克隆检测引物
[0087]
f链：
[0088]
空载1：sga
‑
t：gaccatagcacaagacaggcgt
[0089]
空载2：sgb
‑
t：cgaatgagccctgaagtctgaac
[0090]
空载3：sgc
‑
t:catttcattacctctttctcc
[0091]
r链：靶位点引物的r链
[0092]
挑选正确的单克隆，摇菌。
[0093]
6、抽提质粒
[0094]
具体操作步骤如下：
[0095]
(1)从lb固体培养基平板中挑取单克隆接种至终浓度为50μg/ml的卡那抗性lb液体培养基中，37℃过夜培养；
[0096]
(2)取4ml活化菌液，室温10000rpm离心2min，彻底弃除上清；
[0097]
(3)取250μl含核糖核酸酶a的solutionⅰ试剂彻底重悬菌块；
[0098]
(4)取250μl solutionⅱ试剂裂解菌块，上下轻轻颠倒数次直至菌体透明；
[0099]
(5)取350μl solutionⅲ试剂，颠倒数次，直至形成白色紧实絮状物；
[0100]
(6)室温12000rpm离心10min，取上清；
[0101]
(7)从试剂盒中取出核酸纯化柱，放置于收集管上；
[0102]
(8)取上述操作步骤6的澄清上清至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
[0103]
(9)取500μl的buffer w1至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；
[0104]
(10)取700μl的buffer w2至核酸纯化柱中，室温12000rpm离心30s，弃滤液；
[0105]
(11)重复上述操作步骤10；
[0106]
(12)将核酸纯化柱放置于收集管上，室温12000rpm空离2min，尽可能除去残留液体；
[0107]
(13)弃收集管，取核酸纯化柱置于1.5ml ep管中，并加入50μl洗脱液洗脱核酸纯化柱膜上附着的dna(洗脱液可事先置于65℃恒温水浴锅内预热，有助于洗脱dna)，室温静置2min；
[0108]
(14)室温12000rpm离心2min，洗脱核酸纯化柱膜上附着的dna，并于
‑
40℃低温冰箱保存备用；
[0109]
(15)取微量回收产物，采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提质量。7、测序：把抽提的质粒各送2个单克隆，测序
[0110]
8、终载体连接
[0111]
采用同尾酶连接的方法，一次将多个含有靶位点的中间载体片段连入终载体。
[0112]
如图4
‑
5所示，以3个片段连接连接体系：
[0113][0114]
9、终载体检测引物
[0115]
poscas9
‑
s：gatgggtttttatgattagagtcc
[0116]
强cas9
‑
:ggctcgtatgttgtgtgg
[0117]
大小：1600bp左右。
[0118]
采用常规方法转化，获得该基因的突变体zmbsn1crispr，并进行了盐胁迫试验，结果表明，未经胁迫处理的wt、zmbsn1crispr没有发现明显的差异，而在150mm nacl处理14天后，zmbsn1crispr出现明显的滞后，且株高明显低于其wt(图6)。
[0119]
实施例5基因编辑突变体离子分析
[0120]
对选取生长一致且为三叶一心期的wt、zmbsn1
crispr
进行150mm nacl胁迫，在胁迫0h、24h、48h、72h时，取其叶片进行na
+
、k
+
、ca
2+
的测定分析，结果显示，在胁迫72h后，zmbsn1
crispr
叶片中的na
+
明显高于其wt，且呈极显著相关，说明该基因与na
+
的转运高度相关(结果见图7)。
[0121]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。