基因GhKNOX6在棉花纤维细胞伸长中的应用的制作方法

基因ghknox6在棉花纤维细胞伸长中的应用
技术领域
1.本发明涉及棉花基因工程领域，特别涉及基因ghknox6在棉花纤维细胞 伸长中的应用。


背景技术：

2.转录因子在棉纤维发育过程中发挥重要作用(wang et al.,2019；yan etal.,2018)。本课题组前期通过赤霉素处理棉花胚珠筛选出16个高调的转录 因子，其中包括了knox家族蛋白ghknox6以及blh家族蛋白ghblh1。经实验证 实ghknox6和ghblh1两个转录因子之间存在蛋白相互作用。并且本研究团队应 用棉花转基因技术历时4个月，获得了ghknox6的过表达植株ghknox6-oe，以 及ghknox6-crispr-cas9基因敲除材料。表型分析发现ghknox6-oe植株的纤维 长度显著长于野生型棉花，而ghknox6-crispr-cas9植株的纤维长度显著短于 野生型；其次，本研究对纤维发育不同阶段中ghknox6的表达量分析发现，在 纤维发育的早期阶段ghknox6的表达量显著上调。结合以上结果，ghknox6是 一个棉花中能够促进纤维发育的基因。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何调控棉花的纤维伸长发育，依据是在 赤霉素存在下，della蛋白ghslr1通过蛋白酶体途径被降解并释放与其互作 的ghblh1，进而ghblh1通过mid结构域和homeodomain结构域与转录激活因 子ghknox6蛋白发生互作，将本发明中的ghknox6基因转入棉花中后，可以 调控棉花纤维细胞的发育，从而可以显著增加棉花纤维的长度。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基因ghknox6在棉花纤维 细胞伸长中的应用，包括基因ghknox6在棉花纤维细胞伸长中的应用，其特 征在于，所述ghknox6的核苷酸序列为seq id no.1所示的序列。
5.优选的，基因ghknox6在棉花纤维细胞伸长中的实验方法，包括以下方 法：
6.首先利用qrt-pcr技术，检测ghknox6在纤维不同发育时期的表达量， 显示ghknox6在开花后5d的纤维中表达量最高，之后表达量下降，推测 ghknox6可能在棉花纤维的伸长期发挥重要作用。
7.接下来又将ghknox6过表达和crispr-cas9载体，转入棉花中，筛选得 到ghknox6转基因棉花。
8.同时，检测野生型棉花、过表达棉花和基因敲除株系的纤维长度。结果 显示过表达ghknox6显著增加纤维长度，而ghknox6基因敲除后显著抑制纤 维长度，说明ghknox6基因调控纤维细胞发育。
9.本领域的普通技术人员可采用已知方法，对本发明的基因ghknox6的核 苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰后得到的具有与本发明基因ghknox6 的核苷酸序列75％或是更高同一性的核苷酸，只要编码基因ghknox6且具有基 因ghknox6的功能，均是衍生于本发
明的核苷酸序列且等同于本发明的序列。
10.上述应用中，所述植物可视为如下的任一种：
11.双子叶植物，单子叶植物，禾本科植物，十字花科植物，棉花，陆地棉，海岛棉，亚洲棉，拟南芥，野生型拟南芥columbia。
12.上述应用中所述的棉花发育为纤维细胞的发育。
13.优选的，一种培育转基因植物的方法,包括如下步骤：
14.向受体植物中导入编码基因ghknox6，得到生长发育不同于所述受体植物的转基因植物，所述基因ghknox6可通过向受体植物中导入重组质粒实现，所述重组质粒具体可视为重组质粒pbi121-ghknox6，pentr-msr-ghknox6。
15.本发明的技术效果和优点：
16.本发明所涉及的ghknox6基因为一个转录激活因子，可调控棉纤维发育，促进细胞伸长。本发明的ghknox6基因转入棉花中后，可使棉花纤维伸长，对棉花纤维品质的研究和改良具有重大的意义。
附图说明
17.图1：ghknox6过表达转基因棉花植株分子鉴定。
18.图2：ghknox6-crispr-cas9转基因棉花植株分子鉴定。
19.图3：ghknox6在棉纤维不同发育时期的表达分析。
20.图4：ghknox6转基因拟南芥表型。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了如图1-4所示的基因ghknox6在棉花纤维细胞伸长中的应用，
22.下述实例中，试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
23.所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到；
24.定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值；
25.材料选择分别为开花后0、3、5、10、15、20天的棉花纤维组织，在文中简称为0dpa，3dpa等，以此类推。
26.棉花品种徐州棉142，公众可从，获得该生物材料。
27.野生型拟南芥columbia记载在如下文献中：
28.agigon，armatos，dlaffray，yzuily-fodil，atpham-thi.effectofdroughtstressonlipidmetabolismintheleavesofarabidopsisthaliana(ecotypecolumbia).annalsofbotany,2004,94(3):345-351.
29.根癌农杆菌gv3101记载在如下文献中：肖卫民，赵名琛，邹敏，苏承刚，杜小兵.拟南芥受伤和接种根癌农杆菌gv3101对转录的影响.《农业生物技术学报》,2013,21(5):537-545.
30.质粒pbi121记载在如下文献中：曹家树，向珣，余小林，叶纨芝.pbi121表达载体及其转化植株的快速鉴定.《浙江大学学报》2008.34(2):137-142。光暗交替培养即光培养和暗培养交替，具体培养周期具体可为：14小时光照培养/10小时黑暗培养。
31.实施例1、ghknox6基因在棉花纤维发育不同时期的表达模式
32.1、提取徐州棉142纤维发育不同时期0dpa、3dpa、5dpa、10dpa、15dpa、20dpa纤维组织的rna，反转录成第一条链cdna，根据优势基因序列设计引物，ghknox6-qrt-f:gcttcactggtgggatcttca和ghknox6-qrt-r:gttccccgaaggtttccaat进行q-pcr扩增。
33.2、完成上述实验所使用的程序为95℃预变性15s；
34.95℃变性5s，60℃复性34s，72℃延伸40s(数据接收)；(共40个循环)。
35.4、完成上述试验所用内参基因为ghubq7,引物序列为
36.ghubq7-f:ggcattccacctgaccaacaa，
37.ghubq7-r:ccgcattagggcactcttttc
38.4、上述每个反应均设置3次生物重复和3次技术重复，相对定量的差异表达分析采用2
–
δδct
法，该方法记载在如下文献中(analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2
–
δδct
method.livakandschmittgen,2001:25,402-408.
39.5、定量表达的结果分析见图3。
40.6、结果证明：ghknox6在5dpa显著高表达，之后表达量下降，推测ghknox6可能与纤维伸长发育有关。
41.实施例2：ghknox6转基因棉花植株的获得和表型分析
42.一、重组质粒pbi121-ghknox6过表达的构建
43.1、用引物扩增得到目的基因片段。
44.2、同源重组的方法将目的基因片段连接到载体pbi121中，得到重组质粒pbi121-ghknox6，引物序列见下表。
[0045][0046]
3、将重组质粒pbi121-ghknox6导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。
[0047]
二、重组质粒crispr-cas9-ghknox6基因敲除载体的构建
[0048]
1、用包含接头序列的引物扩増一段大约500bp目的基因特异片段。
[0049]
2.通过bp酶连接至rnai干扰载体phellsgate4，引物序列见下表。
[0050][0051]
3.连接产物转化trans1-t1感受态细胞，分别用xhoⅰ和xbaⅰ单酶切鉴定， 如果两次单酶切的片段大小一致说明载体构建成功。
[0052]
4.将重组质粒pbi121-ghknox6导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。
[0053]
三、转基因植株的获得将重组农杆菌侵染棉花的下胚轴段，获得胚性愈伤组织，和无菌苗， 嫁接后鉴定阳性苗获得阳性植株，加代繁殖得到t3代纯合转基因植 株。进行分子检测，结果见图3。
[0054]
四、ghknox6转基因棉花纤维长度的测量
[0055]
1、随机选取过表达棉花株系和基因干涉株系的成熟纤维各10株，每 株随机取15个棉桃，将纤维数次拉扯后使纤维平行，同时去掉附着 的纤维。将纤维束放在黑色绒板上，用标尺衡量长度，见图3。结果 显示过表达ghknox6-oe显著增加纤维长度，而敲除 crispr-cas9-ghknox6基因显著抑制纤维长度，说明ghknox6基因 调控纤维细胞发育。(统计结果表明野生型植株纤维长度平均为27 mm，ghknox6过表达植株纤维长度为32mm，过表达植株纤维长 度增加18％；ghknox6基因干涉株系纤维长度为23mm，相对于野 生型纤维长度缩短15％)。
[0056]
seq id no.1
[0057]
atggaagaacactacggttatcattcatcggttgtttaccccatggagac aacccaaccggagaacgtactcagttatcttcctgttgtaaactactcg actcagccacctgcctttgaggagcacgtgtttgggttatctgggtcgt cacctgggatatccgatgctgattcagtgattgctgagattccaagagct ggttttgaagatgaccggctttcaagtactgctattagggctaaaattgc ctctcaccctctttaccctaaactacttcaagcccatatagattgccaca aggtggggacaccgccggcgatagcgacaattttagatgaaatgggcgg agccgatgaaagaggcttagacttagttccgtgcagcgtggatgcggat ccccagcttgatcacttcatggaaacttactgcgaaatgttggtgaagt tcaaatcagatctgtcaaagccatttgatgaagccaccacgtttcttaac agtattcaaatgcagctttctcatctctgcaatgggtcatcggaagaaga cttaagtggaggtgagatggtaccccatgattatcacaaaaatggagac cctcaactcaaagacaaactcttggagaaatatagtggttatattagtac acttaagcatgaattttcaaaacacaaaaagaaaggcaaactacctag agatgcaaggcaaatattgcttcactggtgggatcttcactataaatggc catatccaacggaagcagacaaggttggtctagctgaagcaacaggac tggaccagaaacagataaacaactggtttataaatcaaaggaaacgaca ttggaaaccttcggggaacatgcaaatcgcaattatggacaatttatatg gaccgttttccatgaatgtataa。
[0058]
本发明使用到的标准零件均可以从市场上购买，异形件根据说明书的和 附图的记载均可以进行订制。
[0059]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。