一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法

1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法。


背景技术：

2.番茄(solanum lycopersicum)属于茄科的草本植物。番茄的营养丰富，据分析，含有糖3％
‑
5.5％，蛋白质0.7％
‑
1.3％，纤维素0.6％
‑
1.6％，果胶质1.3％
‑
2.5％，有机酸0.15％
‑
0.75％，脂肪0.2％
‑
0.3％，矿物质0.5％
‑
0.8％。同时，番茄维生素含量也很丰富，100g鲜果中含有0.27mg的维生素a，0.03mg的维生素b1，0.02mg的b2，18.5
‑
25mg的维生素c，0.88
‑
402mg的番茄红素，此外还含有锰、铜、碘、锌等，因此，番茄具有较高的营养价值；番茄在我国有广泛栽培。园艺果品在储藏过程中的病菌侵袭问题，一直是制约世界各国园艺产业发展的一个主要因素。如何提高番茄的抗病能力，依然是目前面临的问题。寻找新的提高番茄抗性的基因，对于番茄分子育种具有重要的作用。
3.在育种中，抗病育种是主要的研究方向。对番茄进行抗病育种研究，能够提高番茄生产品质与产量。目前，已经发现有多个基因控制植株的抗病性。例如在棉花中沉默ghsdh
‑
1，接种实验表明，与对照相比沉默植株更容易受到大丽轮枝菌的影响。利用pvy(potato virus y，马铃薯y病毒)对gmnh23过表达马铃薯幼苗进行侵染，发现与野生型植株相比，转基因植株的症状明显减轻。在番茄中，slrop9和slrop1
‑
like与番茄抗白粉病的作用相关。在植物防卫反应中，沉默slrop9基因植株活性氧的产生以及过敏性坏死的形成明显降低。沉默slrop1
‑
like基因植株在植物抗病性反应中出现相似的变化。由此可见，筛选调控番茄抗病性相关基因，利用高表达转基因番茄植株，或利用基因编辑技术对相关基因进行突变，是提高番茄抗病性的重要方式。因此，寻找新的参与调控番茄抗病性的功能基因，依然是园艺领域的重要目标，有助于提高农作物的产量。
4.植物中普遍存在产生氰化物的现象，比如在植物种子的萌发过程中都会释放一定量的氰化氢(hcn)，其中包括非食用种子(如胡萝卜、青椒和苹果等植物的种子)和食用种子(如大豆、大麦、花生和水稻等植物的种子)。由于氰化物对呼吸链的抑制作用，因此其一般会抑制植物的生长。生氰植物很显然需要这种能够解除由生氰糖苷和氰脂产生的氰化物毒性的途径。大部分能生氰的物种都有β
‑
cas通路，其中的关键酶
‑
氰丙氨酸合成酶能够催化cys和hcn合成非蛋白氨基酸
‑
氰丙氨酸和硫化氢。在最近的研究当中，有大量的实验表明，cas在植物对非生物胁迫的响应中具有非常重要的作用。桦木属植物暴露于臭氧中时，乙烯的产生量增加，同时cas的转录活性也大大提高。在干旱胁迫下，烟草组织中的氰化物浓度上升，两天后由于cas的活性的提高，氰化物的浓度下降，从而减少了对细胞的伤害，因此cas在烟草对抗干旱胁迫中发挥了重要作用。在拟南芥中，干旱胁迫同样在一定程度上使cas酶的活性提高，cas突变体atcysc1相比较于野生型和半胱氨酸合成酶的突变体atcysa1对干旱的环境更加敏感，cas的活性也较之更低，表明了在干旱的胁迫下，cas降解氰化物的能力使拟南芥对干旱的耐受性得到提高。然而，番茄cas1高表达植株具有什么表型，尚未有报道，因此推测cas1基因高表达，导致内源hcn含量降低，可能增强番茄抗病性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种提高番茄植株抗病性的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
7.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种提高番茄植株抗病性的方法，其特征在于：包括下列步骤：
8.步骤1：以番茄cdna为模板，以第一轮引物进行第一轮pcr扩增，然后以第一轮pcr扩增产物为模板，以第二轮引物进行第二轮pcr扩增，纯化后得到第二轮pcr扩增产物；第一轮引物包括：
9.第一轮正向引物
‑
f1：5
’‑
agagatagacatttacaggcttca
‑3’
；
10.第一轮反向引物
‑
r1：5
’‑
ttgaacactaatcaactgatacagg
‑3’
；
11.第二轮引物包括：
12.第二轮正向引物
‑
f2：5
’‑
cgcggatccataaatttcatcaatggcgtcgttg
‑3’
；
13.第二轮反向引物
‑
r2：5
’‑
ccgctcgagatcaactgatacaggttgcatgttt
‑3’
；
14.步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121和第二轮pcr扩增产物分别进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pbi121载体和目的基因片段；
15.步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行连接，得到cas1
‑
pbi121质粒；
16.步骤4：将cas1
‑
pbi121质粒转化至eha105农杆菌感受态细胞；
17.步骤5：含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌感受态细胞侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
18.优选的技术方案为：步骤1中，第一轮pcr扩增体系为50μl，其中含有4μl的番茄cdna，1μl的第一轮正向引物
‑
f1，1μl的第一轮反向引物
‑
r1，4μl的dntp，1μl的高保真dna聚合酶，10μl的5
×
pfu buffer，29μl的无菌ddh2o；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸85s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮pcr扩增体系为50μl，其中含有4μl的第一轮pcr扩增产物，1μl的第二轮正向引物
‑
f2，1μl的第二轮反向引物
‑
r2，4μl的dntp，1μl的高保真dna聚合酶，10μl的5
×
pfu buffer，29μl的无菌ddh2o；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min25s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮pcr扩增产物使用普通dna纯化试剂盒进行纯化回收。
19.优选的技术方案为：步骤2中，载体pbi121酶切总体系为50μl，其中含有20μl的载体pbi121，2μl的限制性内切酶xhoi，2μl的限制性内切酶bamhi，5μl的cut smart buffer，21μl的无菌ddh2o；在37℃条件下酶切4h，然后使用dna胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到线性pbi121载体；第二轮pcr扩增产物的酶切总体系为50μl，其中含有20μl的第二轮pcr扩增产物，2μl的限制性内切酶xhoi，2μl的限制性内切酶bamhi，5μl的cut smart buffer，21μl的无菌ddh2o；37℃条件下酶切过夜，然后使用dna胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到目的基因片段。
20.优选的技术方案为：步骤3中，取步骤2中获得的酶切后得到的目的基因片段和线性pbi121载体进行连接，连接总体系为10μl，其中包括4μl的线性pbi121载体，3μl的目的基因片段，1μl的t4连接酶与2μl的10xt4连接酶缓冲液，25℃放置4h；将连接体系加入到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30min，42℃热激45s，冰浴2
‑
3min；在离心管中加入
700μl的lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200μl，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10μl无菌水中吹吸混匀，取2μl菌液进行菌落鉴定，挑取6个阳性克隆测序。
21.优选的技术方案为：步骤4中，将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入1μl的cas1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于700ml液体lb培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养2
‑
3h；5000rpm离心1min，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌液涂布于含卡那霉素和利福平的lb平板上，倒置放于28度培养箱培养2～3天，有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2μl菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10μl的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200rpm振荡培养过夜，得到含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌。
22.优选的技术方案为：步骤5中，将番茄种子用次氯酸钠和酒精清洗消毒以后，播种在生根培养基t0上，暗培养5
‑
7天等待发芽后拿到光照下培养，待芽长成两片子叶时即可准备剪叶子，将番茄子叶剪成小正方形，一片子叶可剪成两半，以及茎剪成小段，将叶和茎摆在预培养基t1上，培养2d后得到外植体；将培养2d后的外植体浸泡于含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回预培养基t1上，暗培养2天后，转至芽诱导培养基t
21
上，使用卡那霉素进行筛选，背面朝下，25℃，16h光照培养7d后，转入新的芽诱导培养基t
21
上继代培养；此后每隔2周更换新的芽诱导培养基t
21
继代培养，待外植体发芽2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t
22
中，培养3
‑
4周，每两周更换新的芽伸长培养基t
22
，当芽伸长至4
‑
5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3
‑
7d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
23.优选的技术方案为：含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液的配置方法：挑取含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的lb液体培养基中，200rpm，28℃过夜；次日取300μl的菌液于20mllb液体培养基中，200rpm，28℃震荡培养6
‑
7h；用分光光度计检测od
600
至0.5
‑
0.6；5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
＝0.1
‑
0.2，即得含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
24.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
25.1、本发明的cas1高表达植株叶片在受到丁香假单胞菌侵染两天后细胞死亡数量、过氧化物含量以及mda含量均低于野生型番茄叶片，可见番茄叶片细胞的抗病能力提高。
26.2、本发明的cas1高表达植株叶片在受到丁香假单胞菌侵染两天后，抗病相关基因slpod、slgox1、slpr1、slnpr1表达量均高于野生型叶片，该基因高表达提高了番茄抗病性。
附图说明
27.图1是cas1基因目的片段一轮pcr、二轮pcr及纯化。
28.图2pbi121质粒酶切纯化。
29.图3番茄cas1高表达鉴定图，即利用卡那抗性基因进行pcr扩增，显示有正确条带。
30.图4番茄cas1高表达鉴定图，即利用pcr技术鉴定cas1高表达植株的cas1基因表达量是否高于野生型番茄。
31.图5野生型番茄和cas1高表达番茄叶片在丁香假单胞菌侵染2天后的台盼蓝染色和dab染色。
32.图6野生型番茄和cas1高表达番茄叶片在丁香假单胞菌侵染2天后slpod、slgox1、slpr1、slnpr1的基因表达量。
33.图7野生型番茄和cas1高表达番茄叶片在丁香假单胞菌侵染2天后叶片中mda含量。
具体实施方式
34.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
35.请参阅图1
‑
7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
36.实施例1：一种调控番茄侧枝的基因及方法
37.一种提高番茄植株抗病性的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
38.一种提高番茄植株抗病性的基因调控方法，包括下列步骤：
39.步骤1：以番茄cdna为模板，根据mrna的序列分别设计两轮引物。第一轮引物无酶切位点，第二轮的上游引物需从起始密码子或起始密码子前面几个碱基开始，下游引物必须从终止密码子开始，二轮引物需引入酶切位点。以上游引物
‑
f和下游引物
‑
r进行pcr扩增，pcr扩增产物纯化后，得到目的基因片段；
40.第一轮正向引物
‑
f1：5
’‑
agagatagacatttacaggcttca
‑3’
；
41.第一轮反向引物
‑
r1：5
’‑
ttgaacactaatcaactgatacagg
‑3’
；
42.第二轮正向引物
‑
f2：5
’‑
cgcggatccataaatttcatcaatggcgtcgttg
‑3’
；
43.第二轮反向引物
‑
r2：5
’‑
ccgctcgagatcaactgatacaggttgcatgttt
‑3’
；
44.步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对二轮扩增产物和载体pbi121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到目的基因片段和线性pbi121载体；
45.步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行重组，得到cas1
‑
pbi121质粒。
46.步骤4：将cas1
‑
pbi121质粒转化eha105农杆菌感受态细胞；
47.步骤5：含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
48.步骤1中，一轮pcr总反应体系为50μl，其中含有4μl模板(为番茄提取rna后反转录得到的cdna)，1μl正向引物f1，1μl反向引物r1，4μl dntp，1μl pfu酶，10μl 5
×
pfu buffer，29μl无菌ddh2o。二轮pcr与一轮pcr体系相同，只是用一轮pcr产物作为模版，将引物对换成f2与r2。pcr扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸
1min 25s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存。二轮产物使用普通dna纯化试剂盒进行纯化回收。
49.步骤2中，酶切总体系为50μl，其中含有20μl pbi121载体质粒/二轮纯化产物，2μl xho i，2μl bamh i，5μl cut smart buffer，21μl无菌ddh2o。pbi121载体37℃酶切4h，纯化产物37℃酶切过夜。使用dna胶回收试剂盒将得到的酶切产物分别进行切胶纯化。
50.步骤3中，取步骤2中获得的纯化后的目的基因片段和线性pbi121载体进行连接，连接总体系为10μl，其中包括4μl pbi121，3μl基因片段，1μl t4连接酶与2μl 10x t4连接酶缓冲液，25℃放置4h。将连接体系加入到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30min，42℃热激45s，冰浴2
‑
3min；在离心管中加入700μl的lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200μl，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的固体培养基(每100ml固体lb加500μl 10mg/ml卡那霉素)上，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10μl无菌水中吹吸混匀，取2μl菌液进行菌落鉴定，挑取6个阳性克隆测序。
51.进行菌落鉴定时，菌落pcr体系为25μl：2μl菌液、1μl正向引物f2(5
’‑
cgcggatccataaatttcatcaatggcgtcgttg
‑3’
)、1μl反向引物r2(5
’‑
ccgctcgagatcaactgatacaggttgcatgttt
‑3’
)、12.5μl的2
×
taq聚合酶混合体系、8.5μl双蒸水，冰上混匀；pcr参数为：95℃预变性3min；95℃变性15s；55℃退火15s，72℃延伸2min15s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存，待反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合结果，将条带位置正确的单克隆扩大培养，即在菌液中加入lb液体培养基5ml，并加入25μl的浓度为10mg/ml卡那霉素后混匀，37℃，200rpm摇床中振荡培养12
‑
16h，然后提取菌液中的质粒，并将提取的质粒于
‑
20℃保存。在pbi121载体上cas1基因片段的两端设计引物进行测序。
52.步骤4中，将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入1μl的cas1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于700ml液体lb培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养2
‑
3h；5000rpm离心1min，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌液涂布于含卡那霉素和利福平的lb平板(每100ml固体lb加500ul 10μg/ml卡那霉素和500ul 10mg/ml利福平上，倒置放于28度培养箱培养2～3天。有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2μl菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10μl的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200rpm振荡培养过夜，得到含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌。
53.步骤5中，将番茄种子用次氯酸钠和酒精清洗消毒以后，播种在生根培养基t0上，暗培养5
‑
7天等待发芽后拿到光照下培养。待芽长成两片子叶时即可准备剪叶子，将番茄子叶剪成小正方形，一片子叶可剪成两半，以及茎剪成小段，将叶和茎摆在预培养基t1上。将预培养2d后的外植体浸泡于含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回预培养基t1上，暗培养2天后，转至芽诱导培养基t
21
上，使用卡那霉素进行筛选，背面朝下，25℃，16h光照培养7d后，转入新的芽诱导培养基t
21
上继代培养；此后每隔2周更换新的芽诱导培养基t
21
继代培养，待外植体发芽2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t
22
中，培养3
‑
4周，每两周更换新的芽伸长培养基t
22
，当芽伸长至4
‑
5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周，得到生根
的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3
‑
7d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
54.生根培养基t0：：ms盐1.67g，蔗糖12.25g，琼脂5g，ph5.8，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，倒平板待用。
55.预培养基t1：ms盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加激素(750μl 1mg/ml 6
‑
苄氨基嘌呤，75μl 1mg/ml吲哚
‑3‑
乙酸)，混合均匀，倒平板待用。
56.芽诱导培养基t21：ms盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μl 50mg/ml卡那霉素，937.5μl 160mg/ml特美汀，激素(750μl 1mg/ml玉米素，75μl 1mg/ml吲哚
‑3‑
乙酸)，混合均匀，倒平板待用。
57.芽伸长培养基t22：ms盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μl 50mg/ml卡那霉素，937.5μl 160mg/ml特美汀，激素(375μl 1mg/ml玉米素，750μl 1mg/ml赤霉素)，混合均匀，倒瓶待用。
58.生根培养基t3：ms盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μl 50mg/ml卡那霉素，705μl 160mg/ml特美汀，激素(750μl 2mg/ml玉米素，)，混合均匀，倒瓶待用。
59.步骤5中，侵染液的配置：挑取含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的lb液体培养基中(含15ul 10mg/ml的卡那霉素和15ul10mg/ml的利福平)，200rpm，28℃过夜；次日取300μl的菌液于20mllb液体培养基中(含100ul10mg/ml的卡那霉素和100ul10mg/ml的利福平)，200rpm，28℃震荡培养6
‑
7h；用分光光度计检测od
600
至0.5
‑
0.6；5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
＝0.1
‑
0.2，即得含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
60.本发明使用的试剂和材料：
61.[0062][0063]
实施例2：一种调控番茄侧枝的基因及方法
[0064]
一种提高番茄植株抗病性的基因，所述基因的核苷酸序列如seq no.1所示。
[0065]
一种提高番茄植株抗病性的方法，包括下列步骤：
[0066]
步骤1：以番茄cdna为模板，以第一轮引物进行第一轮pcr扩增，然后以第一轮pcr扩增产物为模板，以第二轮引物进行第二轮pcr扩增，纯化后得到第二轮pcr扩增产物；第一轮引物包括：
[0067]
第一轮正向引物
‑
f1：5
’‑
agagatagacatttacaggcttca
‑3’
；
[0068]
第一轮反向引物
‑
r1：5
’‑
ttgaacactaatcaactgatacagg
‑3’
；
[0069]
第二轮引物包括：
[0070]
第二轮正向引物
‑
f2：5
’‑
cgcggatccataaatttcatcaatggcgtcgttg
‑3’
；
[0071]
第二轮反向引物
‑
r2：5
’‑
ccgctcgagatcaactgatacaggttgcatgttt
‑3’
；
[0072]
步骤2：用限制性内切酶bamhi和限制性内切酶xhoi对载体pbi121和第二轮pcr扩增产物分别进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pbi121载体和目的基因片段；
[0073]
步骤3：目的基因片段和线性pbi121载体进行连接，得到cas1
‑
pbi121质粒；
[0074]
步骤4：将cas1
‑
pbi121质粒转化至eha105农杆菌感受态细胞；
[0075]
步骤5：含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌感受态细胞侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗。
[0076]
优选的实施方式为：步骤1中，第一轮pcr扩增体系为50μl，其中含有4μl的番茄cdna，1μl的第一轮正向引物
‑
f1，1μl的第一轮反向引物
‑
r1，4μl的dntp，1μl的高保真dna聚合酶，10μl的5
×
pfu buffer，29μl的无菌ddh2o；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸85s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮pcr扩增体系为50μl，其中含有4μl的第一轮pcr扩增产物，1μl的第二轮正向引物
‑
f2，1μl的第二轮反向引物
‑
r2，4μl的dntp，1μl的高保真dna聚合酶，10μl的5
×
pfu buffer，29μl的无菌ddh2o；扩增参数为：95℃预变性5min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min25s，38个循环，72℃延伸5min，4℃保存；第二轮pcr扩增产物使用普通dna纯化试剂盒进行纯化回收。
[0077]
优选的实施方式为：步骤2中，载体pbi121酶切总体系为50μl，其中含有20μl的载体pbi121，2μl的限制性内切酶xhoi，2μl的限制性内切酶bamhi，5μl的cut smart buffer，21μl的无菌ddh2o；在37℃条件下酶切4h，然后使用dna胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到线性pbi121载体；第二轮pcr扩增产物的酶切总体系为50μl，其中含有20μl的第二轮pcr扩增产物，2μl的限制性内切酶xhoi，2μl的限制性内切酶bamhi，5μl的cut smart buffer，21μl的无菌ddh2o；37℃条件下酶切过夜，然后使用dna胶回收试剂盒对得到的酶切产物进行切胶纯化，得到目的基因片段。
[0078]
优选的实施方式为：步骤3中，取步骤2中获得的酶切后得到的目的基因片段和线性pbi121载体进行连接，连接总体系为10μl，其中包括4μl的线性pbi121载体，3μl的目的基因片段，1μl的t4连接酶与2μl的10xt4连接酶缓冲液，25℃放置4h；将连接体系加入到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰上静置30min，42℃热激45s，冰浴2
‑
3min；在离心管中加入700μl的lb液体培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养45min；培养得到的菌液4000rpm离心2min，弃上清200μl，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑取单克隆菌落，于10μl无菌水中吹吸混匀，取2μl菌液进行菌落鉴定，挑取6个阳性克隆测序。
[0079]
优选的实施方式为：步骤4中，将容纳有冰水混合状态的eha105农杆菌感受态细胞的试管插入冰中，然后加入1μl的cas1
‑
pbi121质粒，拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；然后接种于700ml液体lb培养基，置于37℃，150rpm摇床中振荡培养2
‑
3h；5000rpm离心1min，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌液涂布于含卡那霉素和利福平的lb平板上，倒置放于28度培养箱培养2～3天，有菌落长出后，用枪头随机挑取若干单克隆菌落，溶于10μl的无菌水中制成菌液，取2μl菌液进行菌落鉴定；向条带位置鉴定正确的菌液中加5ml的lb液体培养基、10μl的浓度为10mg/ml利福平，25μl的浓度为10的mg/ml卡那霉素，置于37℃摇床，200rpm振荡培养过夜，得到含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌。
[0080]
优选的实施方式为：步骤5中，将番茄种子用次氯酸钠和酒精清洗消毒以后，播种在生根培养基t0上，暗培养5
‑
7天等待发芽后拿到光照下培养，待芽长成两片子叶时即可准备剪叶子，将番茄子叶剪成小正方形，一片子叶可剪成两半，以及茎剪成小段，将叶和茎摆在预培养基t1上，培养2d后得到外植体；将培养2d后的外植体浸泡于含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将外植体重新放回预培养基t1上，暗培养2天后，转至芽诱导培养基t
21
上，使用卡那霉素进行筛选，背面朝下，25℃，16h光照培养7d后，转入新的芽诱导培养基t
21
上继代培养；此后每隔2周更换新的芽诱导培养基t
21
继代培养，待外植体发芽2
‑
3cm时，转入芽伸长培养基t
22
中，培养3
‑
4周，每两周更换新的芽伸长培养基t
22
，当芽伸长至4
‑
5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基t3中，培养3
‑
4周，得到生根的小苗；将生根的小苗转入土盆内，使幼苗生长3
‑
7d，结束后，将番茄小苗转移至土培室内，16h光照正常生长，得到转基因阳性苗。
[0081]
优选的实施方式为：含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液的配置方法：挑取含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌单菌落于3ml的lb液体培养基中，200rpm，28℃过夜；次日取300μl的菌液于20mllb液体培养基中，200rpm，28℃震荡培养6
‑
7h；用分光光度计检测od
600
至0.5
‑
0.6；5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至od
600
＝0.1
‑
0.2，即得含有cas1
‑
pbi121质粒的eha105农杆菌侵染液。
[0082]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。