转氨酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。


背景技术：

2.手性胺广泛存在于自然界中，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性胺都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
3.手性胺是合成多种生物活性化合物和活性药物成分的重要组成部分，据估计，目前40％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体(top.catal.2014,57,284
‑
300)，这使得手性胺化合物成为制药业的重要组成部分。
4.手性胺的工业生产有多种，主要依赖于烯酰胺从酮前体的金属催化氢化，过程需要昂贵的过渡金属配合物作为催化剂，由于这些过渡金属配合物资源有限，因此难以实现可持续性。同时，从酮前体经不对称合成手性胺的过程需要胺的保护和脱保护步骤，增加步骤和废物，降低收率。
5.催化加氢还原法合成手性胺的方法中催化剂的制备困难而且价格昂贵，设备投资大，生产成本高，对催化剂活性和加氢条件要求很高，而且催化剂有毒性，尤其是氢气中的硫化物，极易发生人员中毒。
6.转氨酶是以磷酸吡哆醛为辅因子，能够催化1个氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺或其副产物酮或α
‑
酮酸的酶类的总称。由于传统的不对称合成胺的化学方法存在不同的局限性，例如低效率，低选择性和对环境污染较严重等问题，同时转氨酶催化合成手性胺具有很高的立体和化学选择性，具有安全性和环境相容性，是绿色环保的过程，被成为绿色化学。同时酶催化往往一步催化到位，具有化学方法不可比拟的优势，转氨酶合成手性化合物成为一种关键的不对称合成技术。
7.尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在放大生产应用中存在很多问题。如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；同时酶活力低导致的酶用量大严重阻碍了酶催化反应的工业应用，一方面酶量大导致反应体积大，降低了催化容器的利用率。同时导致后处理时的体积增大，萃取溶剂量大，使得产品的萃取、浓缩及获得困难，产品收率低，极大的阻碍酶催化的工业应用。而活力高的酶可使酶用量降低，反应体积降低，使得酶催化的工业应用成为可能。因此获得高活的酶极为关键，同时还可扩大酶的底物谱，使得一些转化率极低甚至无活力的酶催化反应顺利进行，达到极好的转化率和极高的产品手性纯度。
8.另一方面，酶催化时易受反应体系中有机溶剂的影响或易受反应高ph，高温度等因素的影响而变性失活，因此增加酶对极端条件的耐受性也极为关键。工业生产手性胺，由于现有底物和氨基供体绝大部分水溶性较差，为了提高手性胺产物生成，需要增加反应体系中的有机溶剂的含量，或者使用碱性氨基供体(如异丙胺)，创造了极为苛刻的反应条件，
使得野生转氨酶极易变性丧失活力，因此需要对有机溶剂和高ph均较好耐受的转氨酶来适应工业生产的需求。


技术实现要素：

9.本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高转氨酶的活性。
10.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由seq id no：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第3位、第5位、第8位、第25位、第32位、第45位、第56位、第59位、第60位、第84位、第86位、第164位、第176位、第178位、第180位、第187位、第197位、第206位、第207位、第242位、第245位、第319位、第324位、第326位、第328位、第370位、第397位、第414位、第416位、第424位、第436位、第437位及第442位。
11.进一步地，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由seq id no：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点之一：l3s，v5s，i8a，i8s，f25l，f25t，q32n，i45w，l59v，f56m，c60f，c60y，f84v，w86h，w86l，w86p，w86n，f164m，f164v，f176y，f176s，a178l，i180v，s187a，t197p，l206m，k207t，v242a，t245a，t245v，r319c，r324a，r324g，e326m，v328a，v328g，l370a，l370d，l370k，t397a，p414g，q416a，e424d，e424t，a436s，a436g，a436p，a436n，a436y，a436q，a436e，m437s，m437a，r442t，r442s，r442q和r442v；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
12.进一步地，c60y+f164v、l3s+v5s、l3s+v5s+f164v、l3s+v5s+c60y、l3s+v5s+c60y+f164v、i180v+l370a及l3s+v5s+l59v；优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：f164v+c60y、e424d+a436g、c60y+f164v+a436p、c60y+f164v+a436n、w86p+f164v、f25l+l59v、f25t+f164v、c60y+f164v+a436y、c60y+f164v+a436q、c60y+f164v+a436e、f164v+m437a、i8a+v328a、i8s+f164v、c60y+f164v+l370a、c60y+f164v+l370d、c60y+f164v+l370k、i45w+f164v、c60y+f164v+f176y、c60y+f176s+f164v、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a、c60y+f164v+r442s、c60y+f164v+r442q、l3s+v5s+s187a+l370a+e424d、c60y+f164v+r442t、l3s+v5s+e424d+l370a、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+l370a、l3s+v5s+f164v+t197p+l370a、l3s+v5s+v328a+e424d、l3s+v5s+l59v+l206m+l370a、l3s+v5s+l370a+e424d、l3s+v5s+f164v+k207t+l370a、l3s+v5s+s244a+l370a、l3s+v5s+f164v+t245a+l370a、l3s+v5s+f164v+t245v+v328a、l3s+v5s+f164v+l370a+t397a、l3s+v5s+l59v+f164v+r319c+l370a+t397a、l3s+v5s+l59v+f164v+l370a、l3s+v5s+l59v+l370a+a436g+q416a、l3+v5s+l59v+l370a+a436g+r442q、l3s+v5s+l59v+v328a+l370a+r442q、l3s+v5s+l59v+l370a+r442l、l3s+v5s+l59v+c60y+f164v+l370a+r442v、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+i180v+s187a+l370a+r442l。
13.进一步地，突变至少还包括如下突变位点或突变位点组合之一：第7位、第32位、第96位、第164位、第171位、第186位、第252位、第384位、第389位、第391位、第394位、第404位、第411位、第420位、第423位、第424位、第442位、第452位及第456位；优选地，所述突变至少还包括如下突变位点之一：k7n、q32l、k96r、v164l、e171d、s186g、v252i、y384f、i389m、i389f、d391e、n394d、l404q、l404q、g411d、q420r、q420k、m423k、e424r、e424k、e424q、
r442h、r442l、g452s及k456r。
14.进一步地，突变至少包括如下突变位点组合之一：
15.l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+y384f+g452s、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+s186g+q420r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+m423k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q420k+e424r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+k7n+e424q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q32l+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389m、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389f+n394d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v164l+k456r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+k96r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q32l+r442h、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+r442l、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v252i、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+e424k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+e424k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+y384f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+e424k+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+s186g+q420r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+i180v+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+v164l+i389f+e424q+k96r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v164l+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+i180v+l370a+g411d+m423k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+v164l+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+v252i、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e424q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+e424q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q+e171d、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+e424q+m423k、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q+e171d+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e424q+k7n、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+i180v
+l370a+g411d+r442l、c60y+f164l+i180v+l370a+g411d+a178l+s186g+s187a+y384f+e171d+i389f+v252i+l404q、c60y+f164v+i180v+l370a+g411d+a178l+s186g+s187a+y384f+e424q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d、c60y+f164v+r442q+g411d、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+g411d、c60y+f164v+l370a+g411d、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+g411d+y384f、c60y+f164v+r442q+y384f、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+y384f、c60y+f164v+l370a+y384f、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+y384f、c60y+f164v+r442q+s186g、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+s186g、c60y+f164v+l370a+s186g、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+s186g、c60y+f164v+r442q+d391e、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+d391e、c60y+f164v+l370a+d391e、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+d391e、c60y+f164v+r442q+e171d、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+e171d、c60y+f164v+l370a+e171d、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+e171d、c60y+f164v+r442q+l404q、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+l404q、c60y+f164v+l370a+l404q、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+l404q。
16.根据本发明的另一方面，提供了一种dna分子。该dna分子编码上述任一种转氨酶突变体。
17.根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述一种dna分子。
18.进一步地，重组质粒为pet
‑
22a(+)、pet
‑
22b(+)、pet
‑
3a(+)、pet
‑
3d(+)、pet
‑
11a(+)、pet
‑
12a(+)、pet
‑
14b(+)、pet
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15b(+)、pet
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16b(+)、pet
‑
17b(+)、pet
‑
19b(+)、pet
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20b(+)、pet
‑
21a(+)、pet
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23a(+)、pet
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23b(+)、pet
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24a(+)、pet
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25b(+)、pet
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26b(+)、pet
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27b(+)、pet
‑
28a(+)、pet
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29a(+)、pet
‑
30a(+)、pet
‑
31b(+)、pet
‑
32a(+)、pet
‑
35b(+)、pet
‑
38b(+)、pet
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39b(+)、pet
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40b(+)、pet
‑
41a(+)、pet
‑
41b(+)、pet
‑
42a(+)、pet
‑
43a(+)、pet
‑
43b(+)、pet
‑
44a(+)、pet
‑
49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset
‑
a、prset
‑
b、prset
‑
c、pgex
‑
5x
‑
1、pgex
‑
6p
‑
1、pgex
‑
6p
‑
2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232
‑
18、puc
‑
18或puc
‑
19。
19.根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
20.进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌bl21
‑
de3细胞或大肠杆菌rosetta
‑
de3细胞。
21.根据本发明的再一方面，提供了一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。
22.进一步地，酮类化合物为其中，r1和r2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；r1和r2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；
23.优选的，r1和r2为碳原子数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基，更优选的为碳原子数1
‑
10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；
24.优选的，所述芳基包括苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、噁二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基和吡咯基氧基；
25.优选的，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基和环庚基；
26.优选的，所述芳烷基为苄基；
27.优选的，所述取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。
28.优选的，所述酮类化合物为优选的，所述酮类化合物为
29.进一步地，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
30.进一步地，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，ph为7～11，优选为8～10，更优选为9～10。
31.进一步地，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25℃～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃。
32.进一步地，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％。
33.进一步地，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中甲基叔丁基醚体积浓度为0％～90％。
34.本发明的上述转氨酶突变体是在seq id no：1所示的转氨酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶，因此这些转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
附图说明
35.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
36.图1示出了本发明实施方式中的sds
‑
page检测蛋白的表达情况的电泳图。
具体实施方式
37.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
38.转氨酶是一类以蛋白质为主体的生物催化剂，而在工业生产过程中往往需要在一定的有机溶剂、压力、ph等易使蛋白质变性的条件，因此需要所用的生物催化剂具有较高的耐受性，以适应工业化生产需要。而野生转氨酶往往其对工业需求条件耐受性较低，从而限制了其广泛应用。
39.来源于arthrobacter citreus的转胺酶ars
‑
ωta可以特意性催化酮类化合物生成氨基产物，但酶对有机溶剂的耐受性较低，酶在高ph中的耐受性较低，同时酶在原核表达系统中的可溶性表达较差，酶对底物的活力较低，从而导致酶使用量较大，对酮类化合物转化少；同时由于酶用量大，也增加了后处理的难度，收率低，步骤复杂。本发明针对转氨酶ars
‑
ωta的以上不足进行改造，改善其有机溶剂耐受性，提高ph耐受性、可溶性表达特性以及活力特性，使其可应用于工业生产条件。
40.酶的理性改造是基于酶的三维分子结构对酶的底物结合部位、辅酶结合部位、表面及其他部位进行改造，以改变酶的催化特性，提高酶活力、选择性等特性。酶的定向进化是一种蛋白质的非理性设计，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，应用易错pcr、dna改组(dna shuffling)等技术，结合高效筛选系统获得具有预期特性的新酶。
41.本发明技术方案通过理性设计和随机突变相结合的技术对ars
‑
ωta蛋白进行理性改造，获得的突变体使用酮类化合物进行活力验证，最终获得对有机溶剂耐受性、对高ph耐受性、可溶性表达、活力、选择性均较好的突变体菌株。
42.理性设计可以通过定点突变的手段进行。其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(pcr)等方法向目的dna片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高dna所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
43.利用全质粒pcr引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。dpn i酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对dpn i敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
44.上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。转氨酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mm iptg诱导过夜。
45.通过采用软件对转氨酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现ars
‑
ωta蛋白是以
5
‑
磷酸吡哆醛(plp)为辅因子的s型转氨酶，对酶活性中性附近的氨基酸进行改造，可提高其酶学性质，如稳定过渡态，降低酶与反应过渡态分子的结合态的自由能，使底物更容易进入活性中性，减少底物空间位阻等；对远离活性中性的氨基酸进行改造，增加促进稳定的化学健，如氢键，二硫键，盐桥，疏水堆积，可改进蛋白的稳定性，增长蛋白半衰期。
46.本发明对ars
‑
ωta蛋白(seq id no：1)进行理性改造，进行氨基酸突变(l3s，v5s，i8a，i8s，i45w，f25l，f25t，q32n，l59v，f56m，c60f，c60y，f84v，w86h，w86l，w86p，w86n，y89f，f164m，f164v，f164y，f176y，f176s，a178l，i180v，s187a，t197p，l206m，k207t，t245a，t245v，r319c，v242a，v328a，v328g，t397a，p414g，e424d，e424t，l370a，l370d，l370k，r324a，r324g，e326m，q416a，a436s，a436g，a436p，a436n，a436y，a436q，a436e，m437s，m437a，r442t，r442s，r442q，r442v，r442a)及其组合突变，优选以pet22b为表达载体，获得含有突变基因的质粒，优选以bl21(de3)为表达菌株，在iptg的诱导下获得突变体蛋白。
47.构建的突变体蛋白进行活力验证，结果见表1：
48.表1
[0049][0050][0051]
上述通过定点突变获得了多个能够使转氨酶突变体催化活力提高到的位点，用10wt湿重细胞，0.02g/ml底物浓度进行活力验证，获得的最优突变体使得活力较母本ars
‑
ωta提高了45倍，然而由于出发菌ars
‑
ωta活力过低，在提高了45倍后的突变体经16h转化仍剩余大量底物不能转化成氨基产物，因此进一步的进行改造，包括有益位点组合及新突变位点的引入，
改造后突变体以5wt～0.5wt湿重细胞，0.1g/ml底物浓度进行活力验证进行活力验证，见表2。
[0052]
表2
[0053][0054]
[0055]
经过上述改造，获得了多个能够使转氨酶突变体催化活力提高的位点，同时进行了有益突变组合，获得了多个活力提高的突变位点组合，最好菌株较ars
‑
ωta活力提高3455倍。最优突变体菌株以0.5wt湿细胞重量，以0.1g/ml底物浓度的反应体系中(体积极小，为10v)进行活力验证，经16h转化后，转化率达到95％以上。
[0056]
可见突变体菌株在催化活力方面获得了极好的改进，由野生菌的基本无催化活力(10wt湿细胞重量，0.02g/ml底物浓度，0.1％转化率)，提高到极好的催化活力：以极少的酶量(0.5wt)和极少的反应体积(10v)达到95％的转化效果。
[0057]
本发明同时对上述理性改造获得的突变体蛋白进行定向进化，获得了对酮类底物活力极大提高(质的提高)的突变体蛋白。以此突变体蛋白为出发菌株，以易错pcr为技术手段进程随机突变，进一步提高其活力和对有机溶剂耐受性、对高ph耐受性等特性。同时结合定点突变技术，交错延伸pcr随机重组技术，对易错pcr获得的有益突变进行不断的累积。获得的突变体构建含随机突变的突变体库，不断增加有机溶剂浓度，不断增加筛选及反应体系ph，设置筛选压力，获得目标特性突变体。突变体以pet22b为表达载体，以bl21(de3)为表达菌株，在iptg的诱导下获得突变体蛋白。含目的蛋白的诱导突变体菌体以超声破碎方式进行细胞裂解释放目标蛋白，以sds
‑
page检测目标蛋白的表达情况。
[0058]
其中，易错pcr是在采用dna聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的dna群体。
[0059]
本发明通过上述随机突变加以定向筛选的方法获得多种突变经活力验证使得突变体对有机溶剂的耐受性提高，对ph的耐受性提高，对底物活力提高，目标蛋白的可溶性提高。
[0060]
耐受性验证：易错pcr获得的突变位点在35％二甲基亚砜中的耐受性提高程度
[0061]
以m76(l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a)为出发菌株获得的有益突变位点在35％二甲基亚砜中验证耐受性结果见表3。
[0062]
表3
[0063][0064]
耐受性验证：易错pcr获得的突变位点在50％甲基叔丁基醚中的耐受性提高程度。
[0065]
以m76(l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a)为出发菌株获得的有益突变位点在50％甲基叔丁基醚中验证耐受性结果见表4。
[0066]
表4
[0067][0068]
获得的有益突变使用迭代
‑
易错pcr
‑
定向筛选方法，同时使用定点突变技术，不断提高突变体菌株的活力及对有机溶剂的耐受性。
[0069]
以不同突变体菌株为出发菌株进行耐受性位点验证：
[0070]
提取不同突变体菌株质粒，以定点突变技术构建突变体菌株，获得的突变体菌株在35％二甲基亚砜中进行耐受性位点的验证，结果如表5：
[0071]
表5
[0072][0073][0074]
+表示在35％二甲基亚砜中酶耐受性提高程度为1％～100％，++表示在35％二甲基亚砜中酶耐受性提高程度为100％～300％，+++表示在35％二甲基亚砜中耐受性提高程度为400％～600％
[0075]
可见经随机突变+定向筛选获得的突变位点对增加菌株在有机溶剂(二甲基亚砜)中的耐受性有明显作用。
[0076]
耐受性验证：易错pcr获得的突变位点在40％二甲基亚砜中的耐受性提高程度
[0077]
以m76(l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a)为出发菌株获得的有益突变位点在45％二甲基亚砜中验证耐受性结果见表6。
[0078]
表6
[0079][0080][0081]
耐受性验证：易错pcr获得的突变位点在70％甲基叔丁基醚中的耐受性提高程度。
[0082]
以m76(l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a)为出发菌株获得的有益突变位点在70％甲基叔丁基醚中验证耐受性结果见表7。
[0083]
表7
[0084][0085][0086]
经改造后的突变体蛋白在溶剂二甲基亚砜和甲叔醚中的耐受性均有极大的提高，同时验证在高ph下突变体的活力。
[0087]
高ph耐受性验证：获得的突变体在ph＝10.0条件下验证40％二甲基亚砜和70％甲基叔丁基醚中的活力，16小时后获得的突变体底物基本转化完全，结果见表8。
[0088]
表8
[0089][0090]
获得的突变体经超声破碎进行破碎，离心获得上清酶液和沉淀酶液，进行sds
‑
page检测蛋白的表达情况，一般可溶性表达的蛋白在上清中以溶解的状态存在，非正常折叠的蛋白以包涵体的形式存在，即为沉淀蛋白。经过sds
‑
page检测，结果如图1所示(注：泳道1：marker，泳道2：ars
‑
ωta可溶性蛋白，泳道3：ars
‑
ωta蛋白包涵体，泳道4：marker，泳道5：突变体m115可溶性蛋白，泳道6：突变体m115蛋白包涵体)，最优突变体蛋白较出发菌提高了大于4倍的可溶性表达。
[0091]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由seq id no：1(seq id no：1：mgltvqkinweqvkewdrkylmrtfstqneyqpvpiestegdylitpggtrlldffnqlccvnlgqknqkvnaaikealdrygfvwdtyatdykakaakiiiedilgdedwpgkvrfvstgseavetalniarlytnrplvvtrehdyhgwtggaatvtrlrsfrsglvgensesfsaqipgsscssavlmapssntfqdsngnylkdengellsvkytrrmienygpeqvaavitevsqgvgstmppyeyvpqirkmtkelgvlwisdevltgfgrtgkwfgyqhygvqpdiitmgkglsssslpagavvvskeiaafmdkhrwesvstyaghpvamaavcanlevmmeenlveqaknsgeyirsklellqekhksignfdgygllwivdivnaktktpyvkldrnfrhgmnpnqiptqiimekalekgvliggampntmrigaslnvsrgdidkamdaldyaldylesgewqqs)所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点之一：第3位、第5位、第8位、第25位、第32位、第45位、第56位、第59位、第60位、第84位、第86位、第164位、第176位、第178位、第180位、第187位、第197位、第206位、第207位、第242位、第245位、第319位、第324位、第326位、第328位、第370位、第397位、第414位、第416位、第424位、第436位、第437位及第442位。优选地，突变至少包括如下突变位点之一：l3s，v5s，i8a，i8s，f25l，f25t，q32n，i45w，l59v，f56m，c60f，c60y，f84v，w86h，w86l，w86p，w86n，f164m，f164v，f176y，f176s，a178l，i180v，s187a，t197p，l206m，k207t，v242a，t245a，t245v，r319c，r324a，r324g，e326m，v328a，v328g，l370a，l370d，l370k，t397a，p414g，q416a，e424d，e424t，a436s，a436g，a436p，a436n，a436y，a436q，a436e，m437s，m437a，r442t，r442s，r442q和r442v；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0092]
本发明的上述转氨酶突变体是在seq id no：1所示的转氨酶ars
‑
ωta的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，具有高可溶性表达特性以及高活力特性，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
[0093]
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的转氨酶对有机溶剂的耐受性。在上述实施方式中，优选转氨酶突变体的氨基酸序列具有以上的同源性并具有或编码具有改进的有机溶剂的耐受性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本技术公开内容的教导下获得这样的变体序列。
[0094]
优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：c60y+f164v、l3s+v5s、l3s+v5s+f164v、l3s+v5s+c60y、l3s+v5s+c60y+f164v、i180v+l370a及l3s+v5s+l59v；更优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：f164v+c60y、e424d+a436g、c60y+f164v+a436p、c60y+f164v+a436n、w86p+f164v、f25l+l59v、f25t+f164v、c60y+f164v+a436y、c60y+f164v+a436q、c60y+f164v+a436e、f164v+m437a、i8a+v328a、i8s+f164v、c60y+f164v+l370a、c60y+f164v+l370d、c60y+f164v+l370k、i45w+f164v、c60y+f164v+f176y、c60y+f176s+f164v、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a、c60y+f164v+r442s、c60y+f164v+r442q、l3s+v5s+s187a+l370a+e424d、c60y+f164v+r442t、l3s+v5s+e424d+l370a、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+l370a、l3s+v5s+f164v+t197p+l370a、l3s+v5s+v328a+e424d、l3s+v5s+l59v+l206m+l370a、l3s+v5s+l370a+e424d、l3s+v5s+f164v+k207t+l370a、l3s+v5s+s244a+l370a、l3s+v5s+f164v+t245a+l370a、l3s+v5s+f164v+t245v+v328a、l3s+v5s+f164v+l370a+t397a、l3s+v5s+l59v+f164v+r319c+l370a+t397a、l3s+v5s+l59v+f164v+l370a、l3s+v5s+l59v+l370a+a436g+q416a、l3+v5s+l59v+l370a+a436g+r442q、l3s+v5s+l59v+v328a+l370a+r442q、l3s+v5s+l59v+l370a+r442l、l3s+v5s+l59v+c60y+f164v+l370a+r442v、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+i180v+s187a+l370a+r442l。
[0095]
根据本发明一种典型的实施方式，突变至少还包括如下突变位点或突变位点组合之一：第7位、第32位、第96位、第164位、第171位、第186位、第252位、第384位、第389位、第391位、第394位、第404位、第411位、第420位、第423位、第424位、第442位、第452位及第456位；优选地，所述突变至少还包括如下突变位点之一：k7n、q32l、k96r、v164l、e171d、s186g、v252i、y384f、i389m、i389f、d391e、n394d、l404q、l404q、g411d、q420r、q420k、m423k、e424r、e424k、e424q、r442h、r442l、g452s及k456r。通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶，因此这些转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
[0096]
更优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：g411d+s186g、g411d+s186g+y384f、g411d+s186g+y384f+v164l、g411d+s186g+y384f+v164l+i389f及g411d+s186g+y384f+v164l+i389f+v252i；进一步优选的，突变至少包括如下突变位点组合之一：l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+y384f+g452s、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+
s187a+i180v+l370a+s186g+q420r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+m423k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q420k+e424r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+k7n+e424q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q32l+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389m、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389f+n394d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v164l+k456r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+k96r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+q32l+r442h、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+r442l、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v252i、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+e424k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+e424k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+y384f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+e424k+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+s186g+q420r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+i180v+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+v164l+i389f+e424q+k96r、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+v164l+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+i180v+l370a+g411d+m423k、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+v164l+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+v252i、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e424q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+e424q、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q+e171d、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+e424q+m423k、l3s+v5s+c60y+f164l+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+i389f+v252i+l404q+e171d+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e424q+k7n、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d+s186g+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+i180v+l370a+g411d+r442l、c60y+f164l+i180v+l370a+g411d+a178l+s186g+s187a+y384f+e171d+i389f+v252i+l404q、c60y+f164v+i180v+l370a+g411d+a178l+s186g+s187a+y384f+e424q、l3s+v5s+c60y+f164v+a178l+s187a+i180v+l370a+g411d、c60y+f164v+r442q+g411d、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v
+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+g411d、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+g411d、c60y+f164v+l370a+g411d、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+g411d+y384f、c60y+f164v+r442q+y384f、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+y384f、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+y384f、c60y+f164v+l370a+y384f、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+y384f、c60y+f164v+r442q+s186g、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+s186g、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+s186g、c60y+f164v+l370a+s186g、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+s186g、c60y+f164v+r442q+d391e、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+d391e、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+d391e、c60y+f164v+l370a+d391e、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+d391e、c60y+f164v+r442q+e171d、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+e171d、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+e171d、c60y+f164v+l370a+e171d、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+e171d、c60y+f164v+r442q+l404q、l3s+v5s+f164v+c60y+i180v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+l370a+l404q、l3s+v5s+c60y+f164v+q420r+l370a+l404q、c60y+f164v+l370a+l404q、l3s+v5s+f164v+c60y+l370a+g452s+l404q。通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的转氨酶，这些转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
[0097]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种dna分子。该dna分子编码上述耐有机溶剂的转氨酶突变体。该dna分子编码的上述转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性。
[0098]
本发明的上述dna分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的dna和rna序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能rna，例如反义rna或非翻译的rna。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
[0099]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种dna分子。上述重组质粒中的dna分子置于重组质粒的适当位置，使得上述dna分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
[0100]
虽然本发明在限定上述dna分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在dna序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在dna序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
[0101]
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pet
‑
22a(+)、pet
‑
22b(+)、pet
‑
3a(+)、pet
‑
3d(+)、pet
‑
11a(+)、pet
‑
12a(+)、pet
‑
14b(+)、pet
‑
15b(+)、pet
‑
16b
(+)、pet
‑
17b(+)、pet
‑
19b(+)、pet
‑
20b(+)、pet
‑
21a(+)、pet
‑
23a(+)、pet
‑
23b(+)、pet
‑
24a(+)、pet
‑
25b(+)、pet
‑
26b(+)、pet
‑
27b(+)、pet
‑
28a(+)、pet
‑
29a(+)、pet
‑
30a(+)、pet
‑
31b(+)、pet
‑
32a(+)、pet
‑
35b(+)、pet
‑
38b(+)、pet
‑
39b(+)、pet
‑
40b(+)、pet
‑
41a(+)、pet
‑
41b(+)、pet
‑
42a(+)、pet
‑
43a(+)、pet
‑
43b(+)、pet
‑
44a(+)、pet
‑
49b(+)、pqe2、pqe9、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pqe70、pqe80、prset
‑
a、prset
‑
b、prset
‑
c、pgex
‑
5x
‑
1、pgex
‑
6p
‑
1、pgex
‑
6p
‑
2、pbv220、pbv221、pbv222、ptrc99a、ptwin1、pezz18、pkk232
‑
18、puc
‑
18或puc
‑
19。更优选，上述重组质粒是pet
‑
22b(+)。
[0102]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌bl21细胞或大肠杆菌dh5α感受态细胞。
[0103]
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种耐有机溶剂的转氨酶突变体。由于本发明的上述转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性，因而利用本发明的转氨酶突变体制备的手性胺可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少酶用量，降低后处理的难度。
[0104]
进一步地，酮类化合物为其中，r1和r2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；r1和r2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；
[0105]
优选的，r1和r2为碳原子数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基，更优选的为碳原子数1～10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；
[0106]
优选的，所述芳基包括苯基、萘基、吡啶基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、苯氧基、萘氧基、吡啶基氧基、噻吩基氧基、噁二唑基氧基、咪唑基氧基、噻唑基氧基、呋喃基氧基和吡咯基氧基；
[0107]
优选的，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、乙烯基、烯丙基、环戊基和环庚基；
[0108]
优选的，所述芳烷基为苄基；
[0109]
优选的，所述取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。
[0110]
优选的，所述酮类化合物为
[0111]
根据本发明一种典型的实施方式，酮类化合物为转氨基反应产物为反应式为
[0112]
在本发明一种典型的实施方式中，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
[0113]
应用本发明的转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，ph为7～11，优选为8～10，更优选为9～10，也就是说ph的取值可以任选为7～11中的值，例如7、7.5、8、8、8.6、9、10、10.5等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃，也就是说温度的取值可以任选为25～60℃中的值，例如30、31、32、35、37、38、39、40、42、45、48、50、51、52、55等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％，例如选10％、15％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中甲基叔丁基醚体积浓度为0％～90％，例如选10％、16％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％、55％、60％、70％、80％、90％等。
[0114]
本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0115]
实施例1
[0116]
ars
‑
ωta突变体及野生酶在无有机溶剂体系对底物1的催化活力：
[0117][0118]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入250μl ars
‑
ωta突变体或野生酶的粗酶液(0.05g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8.5)，加入100mm pb8.5 0.41ml使体系终体积为1ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率，突变体信息及结果见表9。
[0119]
表9
[0120][0121]
表9结果可见ars
‑
ωta突变体较野生菌对底物1的催化活力得到极大幅度提升。经过本发明的改造后，ars
‑
ωta突变体的催化活力极大提高，获得了对原本基本不催化底物的催化活力，扩大了底物谱，同时可见极小的反应体积中进行转化，提高了反应器利用率。
[0122]
实施例2
[0123]
ars
‑
ωta野生酶及突变体在有机溶剂体系(40％)dmso中对底物1的催化活力：
[0124]
10ml反应瓶中，称原料(同实施例1)100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入250μl ars
‑
ωta突变体或野生酶的粗酶液(0.05g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8.5)，加入100mm pb8.5 0.01ml，加二甲基亚砜0.4ml使体系终体积为1ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率，突变体信息及结果见表10。
[0125]
表10
[0126][0127]
nd：未检测到产品生成
[0128]
实施例3
[0129]
耐有机溶剂的ars
‑
ωta突变体及野生酶在70％甲叔醚溶剂体系中催化底物生成手性胺：
[0130][0131]
10ml反应瓶中，称原料(同实施例1)100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入250μl ars
‑
ωta突变体或野生酶的粗酶液(0.05g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8.5)，加甲叔醚1.4ml使体系终体积为2ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，氮气吹干甲叔醚试剂，余下取样100μl，加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率，ars
‑
ωta突变体转化率为95％，ars
‑
ωta野生酶检测不到产物生成，突变体信息及结果见表11。
[0132]
表11
[0133][0134][0135]
突变体m76虽然获得了对底物1的催化活力(实施例三)，但在40％二甲基亚砜中由于对有机溶剂耐受性较低，大部分蛋白变性丧失活力，催化活力大幅降低，而突变体m113和m115仍保持较高的催化活力，说明经进化后的突变体在获得较高催化活力的基础上，对有机溶剂二甲基亚砜的耐受性极大提高。
[0136]
实施例4
[0137]
ars
‑
ωta突变体及野生酶在不同温度和ph条件下的催化活力验证
[0138][0139]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入500μl ars
‑
ωta突变体m52或m115(0.1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝11)，或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝11)，加入100mm磷酸缓冲液ph＝11使体系终体积为5.5ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0140]
结果显示，在极端ph条件下，ars
‑
ωta虽然使用了大量的酶(1g湿细胞)，经催化后
未检测到产品生成，突变体m52未检测到产品生成，而突变体m115使用了较少的酶(0.1g)检测到>80％的产品生成，说明突变体经改造后获得了极好的高ph耐受性，使得酶的催化空间得以提升，高活力和高ph耐受双重优良特性使得其适宜工业生产的需求。
[0141]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入500μl ars
‑
ωta突变体m52或m115(0.1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8)，或野生酶的粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8)，加入100mm磷酸缓冲液ph＝8使体系终体积为5.5ml，与60℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0142]
结果显示，在极端温度条件下，ars
‑
ωta虽然使用了大量的酶(1g湿细胞)，经催化后未检测到产品生成，突变体m52未检测到产品生成，而突变体m115使用了较少的酶(0.1g)检测到>80％的产品生成，说明突变体经改造后获得了极好的高温度耐受性，使得酶的催化空间得以提升，高活力和高温度耐受双重优良特性使得其适宜工业生产的需求。
[0143]
实施例5
[0144]
ars
‑
ωta突变体及野生酶催化底物生成手性胺：
[0145][0146]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入5ml～250μl ars
‑
ωta突变体(1g～0.05g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝7.0和ph＝10.5)，或野生酶的粗酶液(1g ars
‑
ωta母本湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝7.0和ph＝10.5)，加入100mm ph＝7.0的磷酸缓冲液(或ph＝10.5的磷酸缓冲液)0.41ml使体系终体积为3ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0147]
突变体信息及结果如表12所示。结果表明在7.0和10.5两种ph体系下ars
‑
ωta野生酶未见产品生成，而多个突变体在两种ph体系下均检测到产品生成，且部分突变体活力表现优良，如突变体m115使用极少的酶量(0.05g，在ph＝10.5的条件下)转化率>95％，且产品手性纯度极高>99％。ars
‑
ωta经改造后获得的突变体获得了优良的催化活力，同时可在高ph下催化手性胺的生成，且催化效果好，表明突变体在催化活力及耐受性上获得了质的突破。
[0148]
表12
[0149][0150][0151]“nd”表示使用1g湿细胞催化未检测到产品生成，
“‑”
表示在ph＝7的条件下，检测到＜5％的产品生成，“+”表示在ph＝7的条件下，检测到5％～20％的产品生成，“++”表示在ph＝7的条件下，检测到20％～50％的产品生成，“+++”表示在ph＝7的条件下，检测到50％～80％的产品生成，“++++”表示在ph＝7的条件下，检测到80％～90％的产品生成，“+++++”表示在ph＝7的条件下，检测到80％～95％的产品生成，同时在ph＝10.5的条件下，使用0.05g湿细胞催化检测到90～100％％的产品生成。
[0152]
实施例6
[0153]
ars
‑
ωta突变体及野生酶催化底物生成手性胺：
[0154][0155]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入100μl ars
‑
ωta突变体(0.02g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8.5)，或加入野生酶的粗酶液1000μl(0.2gars
‑
ωta湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8.5)，加入100mm pb8.5 0.41ml使体系终体积为3ml，与30℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0156]
突变体信息及结果如表13所示。结果表明ars
‑
ωta野生酶使用10倍于突变体的酶量仅有少量产品生成(＜20％)，突变体如m118、m115等使用极少的酶获得的转化率均>90％，且产品手性纯度极高>99％。同时多个突变体活力相较于ars
‑
ωta母本均得到了极大的提高，获得了极好的催化效果。
[0157]
表13
[0158][0159]
[0160]
“‑”
表示出发菌株使用10倍于突变体的酶量(0.2g)催化获得的转化率低于20％，或表示突变体使用与出发菌同等的酶量(0.2g)催化获得的转化率降低或未增加，“+”表示突变体使用极少量酶(0.02g)使得转化率提高0.2～1倍，“++”表示突变体使用极少量酶(0.02g)使得转化率提高1～2倍，“+++”表示突变体使用极少量酶(0.02g)使得转化率提高2～4倍，“++++”表示突变体使用极少量酶(0.02g)使得转化率提高大于4倍。
[0161]
实施例7
[0162]
ars
‑
ωta突变体及野生酶催化底物生成手性胺：
[0163][0164]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入5ml ars
‑
ωta母本及突变体粗酶液(1g突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8)，加入100mm磷酸缓冲液ph＝8使体系终体积为5.5ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0165]
突变体信息及结果如表14所示，可见经改造后的突变体较初始菌株ars
‑
ωta活力显著提高，产品手性纯度极高>99％。
[0166]
表14
[0167][0168][0169]“+”表示转化率小于20％，“++”表示转化率20％～30％，“+++”表示转化率30％～
40％，“+++”表示转化率40％～50％
[0170]
实施例8
[0171]
ars
‑
ωta突变体及野生酶催化底物生成手性胺：
[0172][0173]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加入5ml或500ul粗酶液(1g ars
‑
ωta或突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8)，加入100mm磷酸缓冲液ph＝8使体系终体积为5.5ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl，naoh调节ph为10，加入2ml mtbe萃取，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品转化率。
[0174]
突变体信息及结果如表15，可见经改造后的突变体较初始菌株ars
‑
ωta活力显著提高，多个突变体可在16h内将底物全部转化为产品，且产品手性纯度极高>99％。
[0175]
表15
[0176][0177][0178]“++”表示使用1g含有目标转氨酶的湿细胞获得的转化率小于50％，“+++”表示使用1g含有目标转氨酶的湿细胞获得的转化率70％～90％，“+++”表示使用0.1g含有目标转氨酶的湿细胞获得的转化率90％～100％。
[0179]
实施例9
[0180]
ars
‑
ωta突变体(m52，m118及m111)及野生酶催化底物生成手性胺：
[0181][0182]
10ml反应瓶中，称原料100mg，加入1mg 5
’‑
磷酸吡哆醛，加入2mm异丙胺盐酸盐，加
入5ml粗酶液(1g ars
‑
ωta或突变体湿细胞经超声破碎制得20％粗酶液，ph＝8)，加入100mm磷酸缓冲液ph＝8使体系终体积为5.5ml，与35℃恒温搅拌16h，体系与12000rpm离心5min后，取样200μl加入2ml乙腈溶解，于12000rpm离心5min后送hplc检测产品生成。经检测发现出发菌ars
‑
ωta的催化体系中不能检测出产品的生成，m52，m118及m111突变体均检测到产品的生成。可见经过改造后突变体获得了对底物的催化活力。
[0183]
实施例10
[0184]
将包含各编码目标转氨酶的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种到含50ug/ml的氨苄青霉素的50ml luria bertani培养基中。细胞在200rpm，37℃恒温摇床中培养生长过夜(约16h)。将培养物5ml接种至2升烧瓶中含有50ug/ml氨苄青霉素的500ml luria bertani培养基中，在200rpm，37℃恒温摇床中培养到od是0.6至0.8时，通过加入异丙基βd
‑
硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.06mm来诱导转氨酶基因的表达，然后将培养液在200rpm，25℃恒温摇床中培养持续约16h。通过离心(6000rpm、15min、4℃)收集细胞，丢弃上清液。将细胞重悬于ph7.0，100mm磷酸缓冲液中，通过超声破碎的方式裂解细胞获得粗酶，将粗酶通过离心的方式(12000rpm、3min、4℃)将上清与沉淀(含包涵体蛋白)分离，获得沉淀用等体积ph7.0，100mm磷酸缓冲液重悬。通过sds
‑
page方式检测上清与沉淀中可溶性蛋白与包涵体蛋白的表达情况。
[0185]
ars
‑
ωta与各突变体的表达结果如下表16，表明突变位点的引入逐步使得突变体蛋白的可溶性表达情况越来越好，初始菌ars
‑
ωta仅有少量蛋白表达在上清，大量的蛋白表达在沉淀，突变体m52使得上清蛋白表达量提高一倍，而最终突变体m115等使得蛋白基本全部表达在上清，沉淀表达极少。突变体的表达情况得到极显著的改善。
[0186]
表16
[0187][0188]
“‑”
表示母本ars
‑
ωta的可溶性表达量：仅少量表达在上清，大多表达在沉淀；“+”表示可溶性表达提高1倍；“++”表示可溶性表达提高2倍；“+++”表示可溶性表达提高大于3倍；“++++”表示可溶性表达提高大于4倍。
[0189]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的上述转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高ph耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性。
[0190]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。