一种RNA类核酸检测试剂保存方法及试剂盒以及使用方法与流程

一种rna类核酸检测试剂保存方法及试剂盒以及使用方法
技术领域
1.本发明涉及一种rna类核酸检测试剂的保存方法，以及依照方法形成的试剂盒和试剂盒的实用方法。


背景技术：

2.rna类核酸检测试剂是先将rna逆转录成cdna再对特定基因进行检测的技术。
3.rna类核酸检测试剂存在较多种酶和多种底物组合使用，酶和底物混合后通常保存有效期较短，而且多种酶容易相互抑制，如taq酶会抑制逆转录酶的活性。技术人员为了避免dna 聚合酶活性被逆转录酶抑制，通常才有如下方法：（1）逆转录和pcr扩增分两步做，通常是先做完逆转录直接灭活逆转录酶，避免抑制dna聚合酶活性；（2）逆转录完后通过苯酚抽提，乙醇沉淀逆转录产物来降低逆转录酶对dna聚合酶抑制水平；（3）添加非同源rna作为载体降低逆转录酶对dna聚合酶抑制水平；（4）添加外源dna；（5）添加t4基因32蛋白来降低逆转录酶对dna聚合酶抑制水平。上述方法中（1）、（2）是通过多步骤来完成，过程比较繁琐而且容易引入新的不可预测问题；（3）
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（5）方法是通过添加一些反应非必须的蛋白或者核酸，添加的蛋白和核酸成本高，而且添加的蛋白和核酸本身的化学活性不是特别稳定，容易因添加物的问题而无法达到预期目的。
4.如何以较少的步骤，交底的成本，且能够去报检测试剂各组分保持长时间稳定有效，是亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本技术实施例通过提供一种rna类核酸检测试剂保存方法及试剂盒以及使用方法，解决了现有技术中多种酶和底物组合使用时酶容易相互抑制，且现有技术步骤繁琐、成本高，试剂各组分不稳定的问题，实现了试剂各组分保存时间长、且稳定，使用时步骤简洁的效果。
6.本技术实施例提供了一种rna类核酸检测试剂保存方法，包括将逆转录酶与50%甘油以及rna抑制剂进行混合制成第一混合物；将下游引物、检测探针、扩增反应液混合制成第二混合物；将taq dna聚合酶、上游引物、反应液混合制成第三混合物，其特征在于，所述第一混合物、第二混合物、第三混合物封装于试剂容器内，所述第一混合物与第二混合之间通过石蜡片分隔；所述第二混合物的另一侧通过石蜡片与第三混合物分隔；所述第一混合物与第二混合物之间的石蜡片的熔点温度，低于所述第二混合物与第三混合之间的石蜡片的熔点温度。
7.进一步的，所述第一混合物与第二混合物之间的石蜡片的熔点温度36
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38摄氏度；所述第二混合物与第三混合之间的石蜡片的熔点温度48
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52摄氏度。
8.一种试剂盒，包括管体，还包括第一石蜡片和第二石蜡片；
所述第一石蜡片固定在管体内，第一石蜡片边缘与管体内壁液密封；所述第二石蜡片固定在管体内，第二石蜡片边缘与管体内壁液密封；所述第一石蜡片与第二石蜡片之间间隔设置；第一石蜡片与管体开口之间封装逆转录酶与%甘油以及rna抑制剂进行混合制成的第一混合物；第一石蜡片与第二石蜡片之间封装下游引物、检测探针、扩增反应液混合制成的第二混合物；第二石蜡片与管体封闭端之间封装taq dna聚合酶、上游引物、反应液混合制成的第三混合物。
9.进一步的，还包括封闭组件，所述封闭组件包括固定环、胶套和端盖；所述固定环用于与管体开口端可拆卸密封固定连接;所述胶套两端开口,用于形成一个弹性的管体扩容空间,使不同混合物能够充分混合;所述胶套一端开口与固定环顶端密封固定连通;所述端盖用于牵拉胶套和改变胶套的形态;所述胶套另一端与端盖底面密封固定;所述端盖底面与固定环通过卡扣连接,当端盖与固定环卡扣固定时胶套伸入管体内。
10.进一步的，所述封闭组件还包括调节组件；调节组件用于在石蜡片上形成孔洞或使石蜡片破裂；所述调节组件包括旋转部、连接轴、套筒、伸缩杆和固定杆；所述旋转部位于端盖的外侧，旋转部与连接轴固定连接，所述连接轴穿过端盖与套筒固定连接；所述套筒为圆柱形筒其远离连接轴的一端开口；所述伸缩杆伸入套筒内，伸缩杆与套筒内壁螺纹配合；所述伸缩杆上开有轴向长槽，所述固定杆一端固定在管体开口边沿，另一端伸入所述长槽中，使套筒旋转时伸缩杆能够沿其轴向移动。
11.进一步的，所述旋转部中心处、连接轴、套筒内壁、伸缩杆位于套筒内的端头以及伸缩杆内芯和端头由金属制成，当对旋转部中心处进行加热时伸缩管的端头能够快速升温。
12.进一步的，所述石蜡片为漏斗状或锥形，其尖端处封闭，且尖端朝向管体开口端。
13.进一步的，所述石蜡片的开口端边缘带有一个纵截面为对称的圆形的环形的石蜡环；所述管体内在第一石蜡片和第二石蜡片定位处固定均固定一个挡环；所述挡环为锥台形，其大直径一端与管体内壁密封固定连接，所述挡环小直径一端朝向管体开口侧，使石蜡环熔融时熔化的石蜡液体能够进入挡环与管体之间的间隙内。
14.一种试剂盒使用方法，包括如权利要求4所述的试剂盒，具体步骤如下：1）分离端盖与固定环；2）通过升温使第一石蜡片熔化，将管体开口端朝下，通过反复牵拉胶套使第一混合物和第二混合物快速混均；3）通过升温使第二石蜡片熔化，通过反复牵拉胶套使第一混合物、第二混合物、第三混合物混均。
15.一种试剂盒使用方法，包括如权利要求8所述试剂盒，具体步骤如下：1）分离端盖与固定环；2）转动旋转部使伸缩杆端头抵触石蜡片的尖端，直接戳破第一石蜡片的尖端或是通过恒温加热装置对伸缩杆端头加热，当端头温度达石蜡片熔化温度使石蜡熔化形成孔洞；通过反复牵拉胶套使第一混合物和第二混合物快速混均；3）重复步骤2）使第二石蜡片的尖端形成孔洞；通过反复牵拉胶套使第一混合物、第二混合物、第三混合物混均。。
16.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：1）通过石蜡对试剂不同组分进行分隔，能够使试剂各组分在常温下稳定长时间保存，并确保检测效果不下降；2）通过对试剂管的扩容，方便对试剂进行混均。
附图说明
17.图1 是本发明结构示意图；图2 是试剂盒结构示意图；图3 是试剂盒端盖打开状态示意图；图4 是带有调节组件的试剂盒结构示意图；图5 是调节组件结构示意图；图6 是石蜡片结构示意图；图7 是挡环结构示意图；图8 是试剂盒使用状态示意图；图9 是混合试剂盒内混合物时状态示意图；图10 扩增图谱；图11 不同预变性时间对扩增反应图谱；图12 双层石蜡下扩增图谱；图13 不加石蜡下的扩增图谱。
18.图中，管体10、挡环11、第一石蜡片20、第二石蜡片30、封闭组件40、固定环41、胶套42、端盖44、调节组件43、旋转部431、连接轴432、套筒433、伸缩杆434；石蜡环50。
具体实施方式
19.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
20.需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
22.rna类核酸检测试剂中含有逆转录酶，dna聚合酶，逆转录引物、核酸扩增引物、核酸扩增的底物dntps（或dutps）及反应缓冲液等，核酸扩增前利用惰性化学成分将多种核酸扩增必须组分物理隔离开来，避免由于各组分混合在一起保存引起性能下降。通过石蜡片将容易发生反应的组分进行组合，实现各组分在常温下保存的长时间的稳定，使试剂能够在常温下长时间保存时性能不下降。
23.实施例一如图1所示，一种rna类核酸检测试剂保存方法，包括将逆转录酶与50%甘油以及rna抑制剂进行混合制成第一混合物；将下游引物、检测探针、扩增反应液混合制成第二混合物；将taq dna聚合酶、上游引物、反应液混合制成第三混合物，其特征在于，所述第一混合物、第二混合物、第三混合物封装于试剂容器内，所述第一混合物与第二混合之间通过石蜡片分隔；所述第二混合物的另一侧通过石蜡片与第三混合物分隔；所述第一混合物与第二混合物之间的石蜡片的熔点温度，低于所述第二混合物与第三混合之间的石蜡片的熔点温度。
24.实际生产时，所述第一混合物与第二混合物之间的石蜡片的熔点温度36
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38摄氏度；所述第二混合物与第三混合之间的石蜡片的熔点温度48
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52摄氏度。
25.通过辛德毕斯病毒的taq
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man探针法扩增检测试剂进行实际测试：所述检测试剂保存方法是针对辛德毕斯病毒的保守区为靶目标，包括：上游引物：cgacagtgagaacagccaga下游引物：cctactttcatcgcggcagt探针：aggcgtacgtcgaattgtcagca所述辛德毕斯病毒扩增目标核苷酸序列为：ttcatgtggggaggagcacaatgtttttgcgacagtgagaacagccagatgagtgaggcgtacgtcgaattgtcagcagattgcgcgactgaccacgcgcaggcgattaaggtacatactgccgcgatgaaagtaggactgcgtatagtg实验一，所述的辛德毕斯病毒taq
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man探针法扩增检测试剂包括扩增反应液、taq dna聚合酶、逆转录酶、上游引物、下游引物、探针、depc
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h2o及由正二十六烷和正二十烷通过特定工艺制成的小室。
26.所述的正二十六烷和正二十烷构成的小室将整个反应体系分成上中下3个独立小室，下层小室含有taq dna聚合酶、上游引物；中间小室含有逆转录用的下游引物、检测探针、扩增反应液；上层小室含有逆转录酶、rna酶抑制剂。反应各组分和石蜡分布图见图1。
27.不同体积的底层石蜡对扩增反应的影响1.在保持反应体系和上层石蜡的体积不变的情况下，改变下层石蜡的体积，石蜡
加入量分别为0ul，10ul，15ul，20ul，25ul。用相同的pcr模板进行扩增，通过荧光定量pcr仪器abi7500扩增的曲线图来确定石蜡的用量。配置如表一：ꢀ12345pcr反应体系20ul20ul20ul20ul20ul上层石蜡15ul15ul15ul15ul15ul下层石蜡0ul10ul15ul20ul25ul1.pcr反应体系中，各组分的体积见表二。
28.表二试剂体积(ul)10xbuffer2.5dntp0.1引物f0.1引物r0.1探针0.05逆转录酶0.05rna酶抑制剂0.2taq酶0.550甘油0.25灭菌depc
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水16.15合计202.pcr扩增条件（见表三）表三3.结论加入石蜡对pcr反应的ct值的影响见表四，扩增图谱见图10。
29.表四下层石蜡体积(ul)ct1ct2ct3平均值023.1323.1723.2023.171023.3223.5023.6823.501523.6123.7723.2823.552023.1523.1523.3923.232523.2423.4423.3423.34经由表一，表四，图10可以看出，加入石蜡的扩增曲线与未加入石蜡的扩增曲线无明显区别。小于10ul的石蜡因无法完全覆盖下层小室，起不到隔离效果，不列入测试范围。
30.实验二，对不同预变性时间对扩增反应的影响进行测试，结果如下1.在保持反应各组分和石蜡体积不变的情况下，对阳模进行梯度稀释，以10的n次方稀释为5个连续梯度，改变预变性的时间，预变性时间分别是3min，10min，15min。使用荧光定量pcr仪器abi7500扩增，观察不同预变性时间对扩增曲线的影响。扩增程序见表五。
31.表五程序反转录预变性pcr150℃：30min95℃：3min（95℃：5s，55℃：60s）x45循环250℃：30min95℃：10min（95℃：5s，55℃：60s）x45循环350℃：30min95℃：15min（95℃：5s，55℃：60s）x45循环2.经pcr仪器扩增后，观察扩增曲线，发现石蜡会导致基线前期不稳定，造成曲线图不同程度的倾斜。重新设定基线范围，对基线进行校正后，三个程序的曲线图差距不大。程序3的曲线调整基线前后差异最小，选取程序3作为扩增程序，扩增曲线见图11。
32.实验三，通过实验一和实验二，选取10ul底层石蜡，15min预变性时间，做辛德毕斯病毒的双层石蜡反应与不加石蜡反应对比，结果见图四，图五。
33.实验三通过实验一和实验二，选取10ul底层石蜡，15min预变性时间，做辛德毕斯病毒的双层石蜡反应与不加石蜡反应对比，结果见图12，图13。
34.如图四和图五所示，双层石蜡的扩增曲线和不加石蜡的扩增曲线各个梯度的ct无明显区别，所加石蜡对pcr扩增无影响。
35.通过本专利方法配置的辛德毕斯病毒taq
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man探针法扩增检测试剂对人工合成rna目的片段进行检测，并与通过普通方法将扩增反应液、taq dna聚合酶、逆转录酶、上游引物、下游引物、探针、depc
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h2o直接混合后进行检测，该专利方法配置的检测结果与普通方法进行对比，在刚配置立即进行荧光pcr扩增检测结果相比较专利法ct值比普通方法结果无明显区别，低浓度样本（500copies/ml）专利法检测结果是检出率100%（20/20），普通方法检测结果是检出率50%（10/20），配置后在
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20℃保存一个月后检测结果。
36.通过对比发现本专利法提高了试剂保存的稳定性，而且提高了试剂的检测灵敏度实施例二如图2
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3所示，一种试剂盒，包括管体10，还包括第一石蜡片20和第二石蜡片30；所述第一石蜡片20固定在管体10内，第一石蜡片20边缘与管体10内壁液密封；所述第二石蜡片30固定在管体10内，第二石蜡片30边缘与管体10内壁液密封；所述第一石蜡片20与第二石蜡片30之间间隔设置；第一石蜡片20与管体10开口之间封装逆转录酶与50%甘油以及rna抑制剂进行混合制成的第一混合物；第一石蜡片20与第二石蜡片30之间封装下游引物、检测探针、扩增反应液混合制成的第二混合物；第二石蜡片30与管体10封闭端之间封装taq dna聚合酶、上游引物、反应液混合制成的第三混合物。
37.这样就对试剂的不同组分形成了隔离，能够确保试剂在常温下保藏时，各组分的稳定，确保最终检测效果的稳定。
38.实施例三在实际使用时，试剂通常是封装在比较小的管体10内，各组分的混均空间非常小，混合之前还要将石蜡的熔化或是把石蜡戳破，操作空间有限。且石蜡熔化或是戳破后碎片会漂浮在液体表面，既不方便搅拌也不方便混合。
39.因此，增设了封闭组件40，所述封闭组件包括固定环41、胶套42和端盖44；所述固定环41用于与管体10开口端可拆卸密封固定连接;所述胶套42两端开口,用于形成一个弹性的管体10扩容空间,使不同混合物能够充分混合;所述胶套42一端开口与固定环42顶端密封固定连通;所述端盖44用于牵拉胶套42和改变胶套42的形态;所述胶套42另一端与端盖44底面密封固定;所述端盖44底面与固定环41通过卡扣连接,当端盖44与固定环41卡扣固定时胶套42伸入管体10内。
40.通过封闭组件40形成了扩容的空间，即使石蜡没有完全熔化，也可以快速混均试剂。而且胶套42的形变能够便于对试剂液体形成冲击，便于快速混均。
41.封闭组件40可以使用医用塑料等一次性材质，简单方便，对管体10进行扩容，方便试剂的混合操作。
42.实施例四如图3
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9所示，在实际对石蜡进行不同温度下熔化时发现，通过不同的温度依次熔化第一石蜡片20和第二石蜡片30，等待的时间比较长。而且石蜡受热后是外侧边缘先熔化，其剩余部分整体上浮到液体表面。在能够进行扩容的情况下，如果液体能够流到扩容后的空间内，进行混合，石蜡不影响混合过程，操作收到影响更小。
43.所述封闭组件40还包括调节组件43；调节组件43用于在石蜡片上形成孔洞或使石蜡片破裂；所述调节组件43包括旋转部431、连接轴432、套筒433、伸缩杆434和固定杆435；所述旋转部431位于端盖44的外侧，旋转部431与连接轴432固定连接，所述连接轴432穿过端盖44与套筒433固定连接；所述套筒433为圆柱形筒其远离连接轴432的一端开口；所述伸缩杆434伸入套筒433内，伸缩杆434与套筒433内壁螺纹配合；所述伸缩杆434上开有轴向长槽，所述固定杆435一端固定在管体10开口边沿，另一端伸入所述长槽中，使套筒433旋转时伸缩杆434能够沿其轴向移动。
44.通过伸缩杆434在石蜡片上开孔，管体10倒置时试剂液体混合流到扩容后的空间内，反复抽拉摆动胶套42即可实现试剂液体的混均。石蜡片的位置还定位在管体10上，不需要再考虑石蜡整体的熔化问题。
45.伸缩杆434在熔化石蜡片时，所述旋转部431中心处、连接轴432、套筒433内壁、伸缩杆434位于套筒433内的端头以及伸缩杆434内芯和端头由金属制成，当对旋转部431中心处进行加热时伸缩管434的端头能够快速升温。可以实用能够恒温的电热棒对旋转部431中心金属部位进行加热，进而使端头升温到石蜡熔融的温度。
46.实施例五扁平的石蜡片在刺破时容易整体裂开，会混入到试剂液体中，干扰后续混均和检测操作。因此，将所述石蜡片设置为漏斗状或锥形，其尖端处封闭，且尖端朝向管体10开口
端。
47.这样，尖端破孔后，倒置管体10分隔的腔室内的试剂液体能够流畅的流入到扩容的空间内。不需要将石蜡片完全熔化或是破碎。而且石蜡片的熔点可以选择相同的熔点，不需要再选择不同的熔点的石蜡片。也不需要将石蜡片完全熔化在进行混合操作。
48.石蜡片的安装过程比较麻烦，所示将所述石蜡片的开口端边缘设置成带有一个纵截面为对称的圆形的环形的石蜡环50；如图6
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7所示。
49.所述管体10内在第一石蜡片20和第二石蜡片30定位处固定均固定一个挡环11；所述挡环11为锥台形，其大直径一端与管体10内壁密封固定连接，所述挡环11小直径一端朝向管体10开口侧，使石蜡环50熔融时熔化的石蜡液体能够进入挡环11与管体10之间的间隙内。
50.实际装配时，挡环11固定在试剂液体分隔区处，然后将石蜡片滑到挡环11处，对挡环11外圆周所在部位的管体10进行加热，使石蜡熔化流入挡环11与管体10之间间隙内，实现石蜡片的固定和试剂液体的分隔。
51.实施例六前述试剂盒的使用方法，包括实施例三种的试剂盒，具体步骤如下：1）分离端盖44与固定环41；2）通过升温使第一石蜡片20熔化，将管体10开口端朝下，通过反复牵拉胶套42使第一混合物和第二混合物快速混均；3）通过升温使第二石蜡片30熔化，通过反复牵拉胶套42使第一混合物、第二混合物、第三混合物混均。
52.实施例七一种试剂盒使用方法，包括如实施例五所述试剂盒，具体步骤如下：1）分离端盖44与固定环41；2）转动旋转部431使伸缩杆434端头抵触石蜡片的尖端，直接戳破第一石蜡片20的尖端或是通过恒温加热装置对伸缩杆434端头加热，当端头温度达石蜡片熔化温度使石蜡熔化形成孔洞；通过反复牵拉胶套42使第一混合物和第二混合物快速混均；3）重复步骤2）使第二石蜡片30的尖端形成孔洞；通过反复牵拉胶套42使第一混合物、第二混合物、第三混合物混均。
53.以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明精神和原则内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。