一株产CBD的工业大麻内生真菌及其应用

一株产cbd的工业大麻内生真菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株工业大麻内生真菌及其应用。


背景技术：

2.大麻二酚cbd作为工业大麻中的非成瘾性成分，是cb1和cb2受体的拮抗剂，不仅可以有效改善thc对机体产生的致幻作用，还以其独特的精神作用及抗肿瘤等方面的活性，吸引了众多学者的关注，现已逐渐成为食品、药品领域中的明星化合物。
3.关于cbd的生产，最初是采用柱色谱等分离技术从工业大麻原料中直接进行提取分离，但这样的提取分离工艺路线复杂，不利于工业化生产，且上述工艺均为从高cbd、低thc的工业大麻种子资源中直接提取，所生产的cbd，产率较低，难以满足市场的需求。
4.随着对cbd需求量的增加，研究学者开始致力于cbd的化学合成。但cbd的纯度不高，而且还有副产物生成。


技术实现要素：

5.本发明是要解决现有化学合成cbd的方法难以满足市场需求的问题，提供一株产cbd的工业大麻内生真菌及其应用。
6.本发明提供一株工业大麻内生真菌，为极细链格孢菌(alternaria tenuissima)hmj01。保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为cctcc no：m20211091。
7.本发明极细链格孢菌hmj01在pda平板培养基上菌落初期灰白色，后变为黑色，菌丝密集，絮状，基质褐色，生长迅速。
8.本发明极细链格孢菌hmj01为好氧菌，能够在pda培养基上生长，最适生长温度为28℃，最适ph值自然。
9.本发明极细链格孢菌hmj01通过its序列比对分析，与alternaria tenuissima mz351314的相似性达到了99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化特征和分子鉴定结果确定，本发明的工业大麻内生真菌hmj01属于极细链格孢菌(alternaria tenuissima)。
10.本发明还提供极细链格孢菌hmj01在抑制细菌活性中的应用。
11.进一步的，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌。
12.进一步的，极细链格孢菌hmj01对屎肠球菌的抑菌圈直径可达10.50
±
0.30。
13.本发明还提供极细链格孢菌hmj01在发酵产cbd中的应用。
14.本发明的有益效果：
15.本发明工业大麻内生真菌为极细链格孢菌(alternaria tenuissima)hmj01，极细链格孢菌hmj01对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌均有一定的抑菌活性作用，其中对屎肠球菌抑菌效
果最强，对屎肠球菌的抑菌圈直径可达10.50
±
0.30。同时本发明极细链格孢菌hmj01的发酵液中含有大麻二酚cbd，为采用hmj01菌株发酵的方法生产cbd奠定了基础。
附图说明
16.图1为工业大麻内生真菌hmj01的菌落形态图；
17.图2为工业大麻内生真菌hmj01的菌丝形态图；
18.图3为工业大麻内生真菌hmj01的pcr扩增产物电泳图；
19.图4为工业大麻内生真菌hmj01的系统发育树；
20.图5为工业大麻内生真菌hmj01发酵液的hplc图谱。
具体实施方式
21.下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
22.实施例1：
23.本实施例工业大麻内生真菌，为极细链格孢菌(alternaria tenuissima)hmj01。保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为cctcc no：m20211091。
24.本实施例工业大麻内生真菌hmj01的获取方法为：
25.(1)材料预处理：于黑龙江省农业科学院绥化分院科技创新农场内，取健康工业大麻(龙大麻5号)茎，冲洗干净后放置阴凉处晾干，无菌刀切成5cm小段，备用。
26.(2)表面消毒：在75％酒精中浸泡1min，然后置于6％naclo中漂洗10min，接着用75％酒精浸泡1min，之后无菌水冲洗3次。确保实验操作不引入外源菌，消毒剂应尽量不破坏内生菌群，尽可能多地分离出内生菌。
27.(3)内生菌分离：将消毒后的实验材料两端各切除1cm后，用无菌手术刀切割成0.5cm的小块，置于pda培养基中，于28℃与恒温培养箱中培养5-7d；
28.(4)阴性对照：取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板，或取适量此冲洗液倒入pda培养基内作对照；另外在相同条件下，将消毒之后的实验材料于培养平板上滚动培养一周，作为对照。
29.实施例2：工业大麻内生真菌hmj01的理化特征和分子鉴定
30.参阅《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，观察菌株hmj01于pda平板培养基(28℃，7d)上菌落形状，颜色，浓密程度，基内菌丝形态及是否产色素等；同时，取hmj01 pda平板(培养时间：2d)，将无菌盖玻片倾斜扦入该平板中，继续培养5d后，取出，镊取盖玻片，置于显微镜下观察，初步确定菌株的分类地位。
31.将hmj01菌种划线接种于pda平板上培养5d，从菌落上挑取适量的菌丝，转接到50mlpda培养基中，28℃，120r/min摇床培养4d。待菌丝长到适量时，抽滤发酵液得菌丝体，25％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，冷冻干燥，低温保存备用。
32.(1)取低温保存备用的菌丝体10mg置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加1.5ml离心管中。加入200μl buffer digestion和2μl巯基乙醇，再加入20μl proteinase k溶液，震荡
混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解。
33.(2)加入100μl buffer pf，充分颠倒混匀，-20℃放置5min。
34.(3)室温10,000rpm离心5min，将上清转移到1.5ml离心管中。
35.(4)加入200μl buffer bd，充分颠倒混匀。
36.(5)加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
37.(6)将吸附柱放入吸附管中，用移液器将溶液及半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再室温10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
38.(7)将吸附柱放回收集管，加入500μl pw solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
39.(8)将吸附柱放回收集管，加入500μl wash solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
40.(9)将吸附柱重新放回收集管，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的wash solution。
41.(10)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μl te buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集dna溶液。提取的dna可立即进行下一步实验或-20℃保存。
42.采用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司生产)，提取纯培养后的内生真菌hmj01菌悬液dna(-20℃下保存)；pcr扩增，pcr反应体系见表1，反应程序见表2。通用引物its1和its4(上海生工生物工程股份有限公司合成)序列如下：
43.its1：5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’44.its4：5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’45.表1 pcr反应体系
46.反应成分体积10
×
pcr buffer2.5μldntp(each 10mm)0.5μltaq plus dna polymerase(5u/μl)0.5μl50mm mgso42μl引物f(10μm)1μl引物r(10μm)1μltemplate(dna)1μlddh2o16.5μltotal25μl
47.表2 pcr循环条件
[0048][0049]
工业大麻内生真菌hmj01的分离结果：
[0050]
从健康的工业大麻茎中分离出内生真菌hmj01，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
[0051]
菌种鉴定结果：
[0052]
对工业大麻内生真菌hmj01菌落形态及菌丝进行形态学观察，菌落初期灰白色，后变为黑色，菌丝密集，絮状，基质褐色，生长迅速。结果如图1和图2所示。
[0053]
采用上海生工ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取工业大麻内生真菌hmj01dna并进行扩增，在500bp附近得到一扩增片段，结果如图3，图3中泳道1为mark，泳道2为内生真菌hmj01。
[0054]
上海生工生物工程公司对菌株hmj01的测序结果见表3所示。
[0055]
表3菌株hmj01的its序列
[0056][0057]
将测序结果利用blast分析并与genbank中的序列进行比对，然后用mega7软件构建内生真菌hmj01的系统发育树，工业大麻内生真菌hmj01系统发育树的构建结果见图4。可知，该内生真菌hmj01与alternaria tenuissima mz351314的相似性达到了99％。可以初步判断内生真菌hmj01属于极细链格孢菌(alternaria tenuissima)。
[0058]
参照《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，结合生理生化特征和测序结果，鉴定内生真菌hmj01为极细链格孢菌(alternaria tenuissima)，命名为极细链格
孢菌(alternaria tenuissima)hmj01。
[0059]
实施例3：抑菌活性实验
[0060]
一、采用牛津杯法。以11株菌为供试菌，分别以100μg/ml链霉素和制霉素溶液作为阳性对照、甲醇为阴性对照，对内生菌发酵液的抑菌活性进行研究。
[0061]
11种供试菌株：金黄色葡萄球菌(staphlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、单增李斯特菌(listeria monocytogenes)、粪肠球菌(enterococcus facalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、大肠杆菌(escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baummanii)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、白假丝酵母(candida albicans)，均购于黑龙江省微生物研究所。
[0062]
二、抑菌试验用培养基：
[0063]
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl 5g，琼脂粉16g，水1000ml；加热至所有药品溶化后，定容至1000ml，调节ph7.0-7.2，121℃高压灭菌30min。
[0064]
马铃薯培养基(pda)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000ml；马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤，再加入糖及琼脂，加热溶化后，定容至1000ml，ph自然，121℃高压灭菌30min。
[0065]
三、发酵液的制备：
[0066]
用接种环挑取活化的工业大麻内生真菌的菌丝，接种于含有50ml pdb培养基的三角瓶中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1
×
107cfu/ml种子培养液。将种子培养液(1
×
107cfu/ml)以20％的装液量接种于装有300ml pdb培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，滤液加3倍体积的95％乙醇醇沉，滤去沉淀后，50℃减压浓缩至近干，用1ml甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
[0067]
四、含试验菌株平板的制作：
[0068]
将活化后的10株受试细菌接于含有na培养基试管平面上，于37℃恒温培养24h；1株真菌接于含有pda固体培养基的试管平面上，于28℃恒温培养3d。取培养好的试管斜面加入无菌水5ml，振荡至所有菌体混悬于无菌水中，滴一滴放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1
×
107cfu/ml，得到菌悬液；再按每100ml培养基中加入1ml菌悬液的比例向50℃培养基中加入菌悬液，混匀后，迅速的分装到灭菌后的空平板(放入牛津杯)中，冷却，成含菌平板，备用。
[0069]
五、抑菌实验：
[0070]
取内生菌发酵液、空白对照品液、阳性对照液各150μl加入到上述平板的孔径中，将含有受试细菌的平板水平放置于37℃恒温箱中培养，24h后测量抑菌圈直径；将含有受试真菌的平板水平放置于28℃恒温箱中培养，3d后测量抑菌圈直径。
[0071]
抑菌活性实验结果：
[0072]
以10株致病细菌和1株致病真菌为指标，对供试品溶液进行抑菌活性测定，其结果如表4。
[0073]
表4工业大麻内生真菌hmj01发酵液抑菌活性结果
[0074][0075]
注：指示菌：a：大肠杆菌；b：枯草芽孢杆菌；c：金黄色葡萄球菌；d：短小芽孢杆菌；e：铜绿假单孢菌；f：单增李斯特菌；g：肺炎克雷伯菌h：鲍曼不动杆菌；i：屎肠球菌；j：粪肠球菌；k：白假丝酵母。
[0076]
从表4可以看出，工业大麻内生真菌hmj01对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌以及屎肠球菌和粪肠球菌均有一定的抑菌活性作用，其中对屎肠球菌抑菌效果最强。
[0077]
实施例4：工业大麻内生真菌hmj01次生代谢产物分析
[0078]
一、对照品溶液的制备
[0079]
称取大麻二酚(cbd)对照品用甲醇稀释溶解，制成质量浓度为0.5mg/ml对照品溶液，备用。
[0080]
二、供试品溶液的制备
[0081]
挑取已活化的工业大麻内生真菌hmj01的菌丝，接种于50ml pdb培养基中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1
×
107cfu/ml种子培养液。将种子培养液(1
×
107cfu/ml)以2％(v/v)的装液量接种于装有300ml pdb培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，50℃减压浓缩至近干，用1ml甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
[0082]
三、空白对照品溶液的制备：
[0083]
取pdb培养液同“供试品溶液制备”操作后，作为空白对照品液。
[0084]
色谱条件：
[0085]
色谱柱：venusil xbp-c
18
柱(柱4.6mm
×
250mm，5μm，usa)；
[0086]
流动相：甲醇-水(78:22)；
[0087]
流速：1ml/min；
[0088]
柱温：25℃；
[0089]
检测波长：220nm；
[0090]
进样量：10μl。
[0091]
四、工业大麻内生真菌hmj01次生代谢产物分析结果
[0092]
工业大麻内生真菌hmj01发酵液次生代谢产物hplc分析结果见图5。图5中a表示大麻二酚(cbd)标准品，b表示内生真菌hmj01发酵液样品，c表示pdb空白样品。
[0093]
从图5可以看出，在工业大麻内生真菌hmj01发酵液中含有cbd，阴性对照无干扰。
说明工业大麻hmj01为cbd产生菌。
[0094]
上述研究说明工业大麻内生真菌hmj01不仅具有较好的抑菌活性，还是cbd产生菌，为采用hmj01菌株发酵的方法生产cbd奠定了基础。