一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法

一种床旁快速检测hpv的lamp引物组、试剂盒及其使用方法
技术领域
1.本发明涉及一种hpv检测的引物组、试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种床旁快速检测hpv的lamp引物组、试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。


背景技术：

2.人乳头瘤状病毒（hpv）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡dna病毒，可在人体内广泛传播，持续感染可导致皮肤黏膜的赘生物、尖锐湿疣和宫颈癌等，因此，快速准确检测hpv对降低宫颈癌发病率具有极为重要的意义。传统的hpv检测方法包括：细胞组织病理学检测、阴道镜检测、电镜检测和宫颈荧光检查等，这些检测方法存在明显的缺点：灵敏度低、特异性差、不能对hpv进行分型，导致无法在临床上常规使用。目前，临床上常规的hpv检测方法主要是：实时荧光pcr、杂交捕获-化学发光和pcr毛细电泳片段分析法等，但存在均需专业设备、专业人员操作，且耗时较长等缺点。
3.现有技术“cn110607399a，用于lamp扩增以检测hpv和分型的引物组合、试剂盒和方法”中公开包含hpv16e6、hpv18e6、hpv31e6、hpv33e7、hpv35e6、hpv39e6、hpv45e7、hpv51e6e7、hpv52e6e7、hpv56e6、hpv58e6、hpv59e6、hpv66e6、hpv68e6和hpv73e6e7等lamp扩增引物组，采用上述引物组合检测hpv的亚型，但该方法具有以下不足：（1）需要提取dna，耗时2小时以上；（2）lamp扩增反应1小时。
4.此外，“cn104805218a基于lamp和分子信标检测hpv16和18的反应体系和方法”中仅检测了hpv16和hpv18，以及该方法存在以下缺点：(1)反应体系中含有分子信标探针，价格较高；（2）耗时久，超过60分钟；（3）lamp反应后，需要在4℃、65℃和95℃条件下用紫外灯照射观察荧光，操作繁琐且需专业设备：紫外灯；“cn106148571a检测人乳头瘤病毒hpv16和hpv18的成套试剂”中检测时间较长，约1小时，且需紫外灯；“cn106939359a一种lamp法检测hpv常见亚型的引物组及检测体系”中检测了hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44，涉及的检测方法耗时较长，超过1小时；需要专门设备，例如：荧光定量pcr仪、涡旋混合器、震荡型恒温金属浴、高速低温离心机、电泳仪、凝胶成像分析仪、流式点阵仪、实时浊度测定仪、电子分析天平、超纯水仪等；“cn110093459a用于快速检测13种高危型hpv的lamp引物组合及应用”中耗时超过1小时，且在反应过程中，需要借助浊度仪检测浊度绘制“s”型曲线。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有技术的不足，而提出了一种床旁快速检测hpv的lamp引物组、试剂盒及其使用方法。其中，发明人针对样本lamp引物组、裂解液和反应体系开展了大量研发工作，筛选了特异性较强的lamp引物组，以及优化了体系溶液组分的最佳配比，并将dna提取和扩增合并为一步法，缩短lamp反应时间，使总反应时间缩短至40min以内，同时，显示出较高的灵敏度和极好的特异性。此外，考虑到环境污染问题，发明人还特别设计密闭式废液收集腔，以达到消除污染的目的。
6.为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
本技术方案提出：一种床旁快速检测hpv的lamp引物组，包括如下核苷酸序列对组合：
7.进一步的，所述hpv包括亚型hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv56、hpv58和hpv68。
8.本技术方案提出：将所述lamp引物组在制备hpv检测试剂中的应用。
9.本技术方案提出：将所述lamp引物组在制备hpv检测试剂盒中的应用。
10.本技术方案提出：一种床旁快速检测hpv的试剂盒，包括所述lamp引物组、裂解液和lamp扩增体系，所述lamp引物组总含量为1-5μm；所述裂解液包括naoh、tris-hcl、sds、triton-x100、np-40和尿素，其中，naoh为5-20mm，tris-hcl为1-5mm，sds为0.05-1%，triton-x100为0.1-2%，np-40为1-10%，尿素为2-10mm，裂解液总体积为50μl；所述lamp扩增体系包括：mgso4、kcl、（nh4）2so4、tween-20、betain、dntps、bst3.0扩增酶和evagreen，其中，mgso4为5-10mm，kcl为25-125mm，（nh4）2so4为0-40mm，tween-20为
0.01-0.5%，betain为0.1-0.25m，dntps为1-5μm，bst3.0扩增酶为0.2-1.0u，evagreen为0.5-1x，反应体系总体积为25μl。
11.优选的，所述lamp引物组中，包括内引物浓度为1.6-2.4μm，外引物浓度为0.1-0.4μm，环引物浓度为0.4-0.8μm。
12.优选的，所述裂解液包括5-10mm的naoh、1-2mm的tris-hcl、0.05-0.1%的sds、0.5-1%的triton-x100、1-5%的np-40和4-6mm的尿素。
13.优选的，所述lamp扩增体系包括6-7mm的mgso4、75-125mm的kcl、10-20mm的（nh4）2so4、0.1-0.4%的tween-20、0.1-0.25m的betain、1-5μm的dntps、 0.5-1x的evagreen和0.2-1.0u 的bst3.0扩增酶。
14.本技术方案还提出一种床旁快速检测hpv的试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：1）样本采集：采用包括但不限于阴道拭子或阴道细胞学刷头，进行样本采集；2）裂解：将离体的样本置于微流控核酸检测装置的加样室中，与预制的样本裂解液混合10min，得裂解液；其中，样本裂解液包括naoh（5-20mm）、tris-hcl（1-5mm）、triton-x100 (0.1-2%)、np-40（1-10%）、sds（0.05-1%）及尿素（2-10mm）；3）扩增：将所得的裂解液进入微流控核酸检测装置的扩增室中，打开加热元件，65℃条件下加热30min，进行lamp扩增；其中，反应体系包括mgso4（5-10mm）、kcl （25-125mm）、（nh4）2so
4 （0-40mm）、tween-20 （0.01-0.5%）、betain（0.1-0.25m）、dntps （1-5μm）、bst3.0扩增酶 （0.2-1.0u）、evagreen （0.5-1x）和扩增引物1-5μm；4）判别：经微流控核酸检测装置上的透明观察窗，肉眼判别扩增后反应液的颜色，若反应液为红色，则为阴性；若反应液为橘黄色，则为阳性；5）后处理：将产生的废液进入至微流控核酸检测装置的废液收集室中，然后以医疗废物垃圾处理。
15.进一步的，所述微流控核酸检测装置包括呈密封设置的壳体及设置在壳体内的加样室、扩增室和废液收集室，加样室设置在扩增室上方，废液收集室设置在扩增室下方，加样室扩增室和废液收集室之间可形成溶液单向流动的通路。
16.在本技术方案中，涉及的术语包括：lamp扩增：环介导等温扩增反应。
17.在本技术方案中，f3表示正向外引物，b3表示反向外引物，fip表示正向内引物，bip表示反向内引物，lb、lf表示环引物。
18.在本技术方案中，涉及的机理如下：加样室内加样孔中含有细胞裂解液，当与样本混合后，可裂解细胞，释放dna；带dna的裂解液进入至扩增室后，与预制的扩增反应体系混合，发生lamp 反应；扩增结束后，引起的ph值变化会使酚红产生颜色改变，颜色的改变通过透明观察窗实现肉眼的可视化判别：红色为阴性，橙黄色为阳性。
19.采用本技术方案，带来的有益技术效果为：一、在本发明中，无需单独提取纯化dna，dna提取和扩增反应的操作为一步法，可
在同一个腔室内完成。基于本试剂盒，保证hpv检测操作简便，结果易懂，无需专业人员解读，也不需要专业培训；二、在本发明中，设计lamp引物的特异性较强，以及通过优化体系溶液组分的最佳配比等，有效缩短了lamp反应时间，保证40min内完成检测，同时，显示出较高的灵敏度和极好的特异性；三、在本发明中，通过采用微流控核酸检测装置，进行恒温扩增，无需其他专业设备。此外，扩增反应在独立腔室（扩增室）内完成，不易形成气溶胶，不易污染。产生的废液最终进入废液收集腔，全称封闭，无环境污染；四、在本发明中，检测体系仅需lamp引物、扩增酶和反应缓冲液，无需探针等其他试剂，有效降低了成本（从几百元降低到几十元）；五、在本发明中，各个环节操作均较简便，无需借助其他专门仪器（比如：荧光定量pcr仪、涡旋混合器、紫外灯等），有效的优化了医疗处置流程，基本上可实现床旁快速自测，极大的方便了医护人员和家属等。
附图说明
20.图1为实施例7中hpv16灵敏度检测结果；图2为实施例7中hpv18灵敏度检测结果。
具体实施方式
21.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
22.实施例1本实施例提出：一种床旁快速检测hpv的lamp引物组，包括如下核苷酸序列对组合：
23.其中，hpv涉及包括亚型hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv56、hpv58和hpv68。
24.实施例2基于实施例1，本实施例提出：将lamp引物组在制备hpv检测试剂中的应用。
25.实施例3基于实施例1，本实施例提出： 将lamp引物组在制备hpv检测试剂盒中的应用。
26.实施例4基于实施例1和实施例3，本实施例提出：一种床旁快速检测hpv的试剂盒，包括lamp引物组、裂解液和lamp扩增体系，所述扩增引物为1-5μm；所述裂解液包括naoh、tris-hcl、sds、triton-x100、np-40和尿素，其中，naoh为5-20mm，tris-hcl为1-5mm，sds为0.05-1%，triton-x100为0.1-2%，np-40为1-10%，尿素为2-10mm，裂解液总体积为50μl；所述lamp扩增体系包括：mgso4、kcl、（nh4）2so4、tween-20、betain、dntps、bst3.0扩增酶和evagreen，其中，mgso4为5-10mm，kcl为25-125mm，（nh4）2so4为0-40mm，tween-20为0.01-0.5%，betain为0.1-0.25m，dntps为1-5μm，bst3.0扩增酶为0.2-1.0u，evagreen为0.5-1x，反应体系总体积为25μl。
27.实施例5
基于实施例4，本实施例更优的提出：lamp引物组中，包括内引物浓度为1.6-2.4μm，外引物浓度为0.1-0.4μm，环引物浓度为0.4-0.8μm；裂解液包括5-10mm的naoh、1-2mm的tris-hcl、0.05-0.1%的sds、0.5-1%的triton-x100、1-5%的np-40和4-6mm的尿素；lamp扩增体系包括6-7mm的mgso4、75-125mm的kcl、10-20mm的（nh4）2so4、0.1-0.4%的tween-20、0.1-0.25m的betain、1-5μm的dntps、 0.5-1x的evagreen和0.2-1.0u 的bst3.0扩增酶。
28.实施例6基于实施例5，本实施例提出一种床旁快速检测hpv的试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：1）样本采集：采用包括但不限于阴道拭子或阴道细胞学刷头，进行样本采集；2）裂解：将离体的样本置于微流控核酸检测装置的加样室中，与预制的样本裂解液混合10min，得裂解液；其中，样本裂解液包括naoh（5-20mm）、tris-hcl（1-5mm）、triton-x100 (0.1-2%)、np-40（1-10%）、sds（0.05-1%）及尿素（2-10mm）；3）扩增：将所得的裂解液进入微流控核酸检测装置的扩增室中，打开加热元件，65℃条件下加热30min，进行lamp扩增；其中，反应体系包括mgso4（5-10mm）、kcl （25-125mm）、（nh4）2so
4 （0-40mm）、tween-20 （0.01-0.5%）、betain（0.1-0.25m）、dntps （1-5μm）、bst3.0扩增酶 （0.2-1.0u）、evagreen （0.5-1x）和扩增引物1-5μm；4）判别：经微流控核酸检测装置上的透明观察窗，肉眼判别扩增后反应液的颜色，若反应液为红色，则为阴性；若反应液为橘黄色，则为阳性；5）后处理：将产生的废液进入至微流控核酸检测装置的废液收集室中，然后以医疗废物垃圾处理。
29.其中，微流控核酸检测装置包括呈密封设置的壳体及设置在壳体内的加样室、扩增室和废液收集室，加样室设置在扩增室上方，废液收集室设置在扩增室下方，加样室扩增室和废液收集室之间可形成溶液单向流动的通路。
30.实施例7基于实施例4，本实施例研究试剂盒检测的灵敏度。
31.将hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv56、hpv58和hpv68的序列分别克隆入puc57载体，以此质粒为模板，运用数字pcr进行准确定量。分别以108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl为模板，分别进行上述的lamp扩增，结果显示：本检测方法的检测最低限为104拷贝/μl。
32.其中，hpv16、hpv18对应的扩增图结果如图1、图2所示。
33.实施例8基于实施例4，本实施例运用交叉验证试剂盒检测的特异性。
34.人工合成以下hpv质粒模板：hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv42、hpv51、hpv52、hpv53、hpv56、hpv58、hpv6、 hpv66和hpv68，按实施例6进行lamp扩增，结果如表1-7所示，可
知：hpv16、hpv18、hpv33、hpv52、hpv56、hpv58和hpv68均与hpv其他型别无交叉反应，说明特异性好。异性好。异性好。
35.实施例9基于本实施例4及实施例6，本实施例以收集的四川大学华西第二医院宫颈部位细胞学刷头79例，其中，hpv阳性55例（hpv16阳性12例、hpv18阳性2例、hpv33阳性10例、hpv52阳性12例、hpv56阳性4例、hpv58阳性13例和hpv68阳性2例），hpv阴性24例，以对本发明做进一步说明。
36.1. 收集四川大学华西第二医院宫颈部位细胞学刷头79例；2. 将细胞学刷头置于便携式微流控核酸检测装置的加样室中，与预制的样本裂解液混合10min，其中，裂解液包含以下成分：naoh（5-10mm）、tris-hcl（1-2mm）、triton-x100 （0.5-1%）、np-40（1-5%）、sds（0.05-0.1%）及尿素（4-6mm）；3. 将裂解液进入扩增室，打开加热元件，65℃条件下加热30min，进行lamp扩增；其中，反应体系如下：mgso4（6-7mm）、kcl（75-125mm）、（nh4）2so4（10-20mm）、tween-20（0.1-0.4%）、betain（0.1-0.25m）、dntps（1-5μm）、bst3.0扩增酶（0.2-1.0u）、evagreen （0.5-1x）；lamp扩增引物如下：hpv16，正向外引物：agacgttatgacatacatacattc，反向外引物：gtctgcagaaaacttttcctt，正向内引物：ttctagtgcctcctgggggaattccactattttggaggac，反向内引物：taacccaggcaattgcttgtcaagtgtattttttaaggggatca，环引物：aaaaacatacacctccagcaccta；hpv18， 正向外引物：cactgaaagttcccatgc，反向外引物：cagtatctaccatatcaccatct，正向内引物：gcccaaaatacataactgtgtctgcacgtctaatgtttctgaggac，反向内引物：ggctaaaggcactgcttgtaaccaaaactgtgtttttaagttct，环引物：gcgtcctttatcacagggcgatt；hpv33， 正向外引物：ctgaggaaaaaccacgaac，
反向外引物：ataagaaccgcaaacacag，正向内引物：ccacgcactgtagttcaatgttattgcatgatttgtgccaa，反向内引物：tgcaacgatctgaggtatatgattttccaaatggatttccctctc，环引物：tctccaatgcttggcacaaa；hpv52， 正向外引物：ataaggctgcagtgtgtg，反向外引物：cacttaatggtttttttaccctc，正向内引物：cacgccatatggattattgtctctaagctacaacgaagagaggt，反向内引物：atgtgcctacgctttttatctaagacttctaatgttttcccatacagt；hpv56， 正向外引物：gcctgtgtatttttttagacgt，反向外引物：ttttggtattgtccttagtcac，正向内引物：ctttgaaacaggtgttggaggtagatattccctatttttttgcagatgg，反向内引物：caacggattcctatgtgaaacgcgtaatagggatgtcctacgg，正向环引物：tcactaggccgccacgt，反向环引物：tattttatcatgcaggcagttcacg；hpv58， 正向外引物：acattgcatgatttgtgtcag，反向外引物：tgtgtctccatatagcgaat，正向内引物：gctgcaaagtctttttgcattcaagcgttggagacatctgtg，反向内引物：atagagatggaaatccatttgcagtctcacttattttagatagcaatcgt；hpv68， 正向外引物：tcctacacaacgaccatac，反向外引物：atgcatttcagacacgct，正向内引物：gcaaaacacacaattgatgcgaataactgcctgatttgagcac，反向内引物：aaggggaactgcaagaaagagagcatacggtgtacagtctc；4. 经微流控核酸检测装置上的透明观察窗，肉眼判别：反应液为红色，则为阴性；反应液为橘黄色，则为阳性。结果如表8-9所示，55例阳性样本中51例判读为阳性；24例阴性样本全部判读为阴性。
37.5. 将产生的废液进入至微流控核酸检测装置的废液收集室中，然后以医疗废物垃圾处理。
38.实施例10基于本实施例4及实施例6，本实施例就裂解液中组分的浓度进行讨论，以对本发明做进一步说明。
39.一、裂解液中naoh浓度讨论设置不同的naoh浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳naoh浓度，所得结果如下表10所示。
40.得出：根据以上结果，5-10mm为最佳naoh浓度。
41.二、裂解液中tris-hcl浓度讨论设置不同的tris-hcl浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳tris-hcl浓度，所得结果如下表11所示。
42.得出：根据以上结果，1-2mm为最佳tris-hcl浓度。
43.三、裂解液中sds浓度讨论设置不同的sds浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳sds浓度，所得结果如下表12所示。
44.得出：根据以上结果，0.05-0.1%为最佳sds浓度。
45.四、裂解液中triton-x100浓度讨论设置不同的triton-x100浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳triton-x100浓度，所得结果如下表13所示。
46.得出：根据以上结果，0.5-1%为最佳triton-x100浓度。
47.五、裂解液中np-40浓度讨论设置不同的np-40浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳np-40浓度，所得结果如下表14所示。
48.得出：根据以上结果，1-5%为最佳np-40浓度。
49.六、裂解液中尿素浓度讨论设置不同的尿素浓度梯度，qpcr扩增检测裂解液效果，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳尿素浓度，所得结果如下表15所示。
50.得出：根据以上结果，4-6mm为最佳尿素浓度。
51.实施例11基于本实施例4和实施例6，本实施例就lamp扩增体系中组分的浓度进行讨论，以对本发明做进一步说明。
52.涉及的lamp扩增体系中组分包括mgso4、kcl、（nh4）2so4、tween-20、betain、dntps、bst3.0扩增酶、evagreen和引物，筛选浓度变化对扩增影响较大的试剂浓度；反应体系的颜色指示剂为酚红。
53.一、lamp扩增体系中mgso4浓度讨论设置不同的mgso4浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳硫酸镁浓度，所得结果如下表16所示。
54.得出：总体mg
2+
浓度越高，越容易产生非特异扩增，因此在扩增效率相差不大时，选择较低的mg
2+
浓度；综合考虑扩增效率和非特异扩增，选择最佳的mg
2+
浓度为6-7mm。
55.二、lamp扩增体系中kcl浓度讨论设置不同的kcl浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳kcl浓度，所得结果如下表17所示。
56.得出：综合考虑扩增效率和非特异扩增，选择最佳的kcl浓度均为75-125mm。
57.三、lamp扩增体系中（nh4）2so4浓度讨论设置不同的（nh4）2so4浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳（nh4）2so4浓度，所得结果如下表18所示。
58.得出：综合考虑扩增效率和非特异扩增，选择最佳的（nh4）2so4浓度为10-20mm。
59.四、lamp扩增体系中tween-20浓度讨论设置不同的tween-20浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳tween-20浓度，所得结果如下表19所示。
60.得出：总体tween-20浓度越高，越容易产生非特异扩增，因此在扩增效率相差不大时，选择较低的tween20浓度；综合考虑扩增效率和非特异扩增，选择最佳的tween-20浓度为0.1-0.4%。
61.五、lamp扩增体系中evagreen浓度讨论设置不同的evagreen浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳evagreen浓度，所得结果如下表20所示。
62.得出：根据以上结果，选择最佳的evagreen浓度为0.5-1x。
63.六、lamp扩增体系中引物浓度讨论设置不同的引物浓度梯度，在自配ph-lamp反应体系下扩增，根据阳性ct值与阴性ct值判断最佳引物浓度，所得结果如下表21所示。
64.得出：内引物浓度在1.6-2.4μm梯度内扩增效率无显著变化；0.1-0.4μm梯度范围内外引物浓度对扩增效率影响相对较低；环引物浓度在0.4-0.8μm梯度内扩增效率无显著变化。