重组醋酸菌及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种重组醋酸菌及其制备方法和应用。


背景技术：

2.食醋，主要成分为醋酸(乙酸、冰醋酸)，是世界上消费量最大的调味品之一，也是食品、医药、化工、纺织等领域广泛应用的化合物之一。醋酸菌(acetic acid bacteria，aab)又名醋酸杆菌，是指能够氧化糖类、醇类生成相应的有机酸的一类革兰氏阴性细菌的总称。目前已知的主要醋酸菌种属包括醋酸杆菌(acetobacter)、葡糖杆菌(gluconobacter)以及葡糖醋杆菌(gluconacetobacter)等，其中，醋酸杆菌属和葡糖杆菌属因其强大的氧化乙醇产生乙酸能力被广泛用于食醋发酵生产。近年来，国内食醋行业发展迅速，但是菌体耐酸性是制约高酸度醋生产的关键因素，如何提高发酵酸度以及改善菌体耐酸性是亟待解决的问题。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种重组醋酸菌。
5.本发明的第二目的在于提供一种重组醋酸菌的制备方法。
6.本发明的第三目的在于提供一种重组醋酸菌的应用。
7.本发明的第四目的在于提供一种醋酸发酵方法。
8.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
9.一种重组醋酸菌，所述重组醋酸菌为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌；
10.苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为seq id no.1所示的核苷酸序列。
11.进一步地，所述醋酸菌将乙醇氧化为醋酸。
12.进一步地，所述醋酸菌包括葡糖杆菌、醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，优选为醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，进一步优选为醋化醋杆菌或巴氏醋杆菌，更进一步优选为巴氏醋杆菌cgmcc 3089或巴氏醋杆菌nbrc 3283。
13.进一步地，苯丙氨酸解氨酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14.进一步地，启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因通过重组载体导入醋酸菌；
15.优选地，重组载体的骨架载体包括质粒pbbr1p264(verena kallnik,maria meyer,uwe deppenmeier,et al.construction of expression vectors for protein production in gluconobacter oxydans.journal of biotechnology 150(2010)460
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465)。
16.上述重组醋酸菌的制备方法，将含有启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因的重组载体导入醋酸菌，得到重组醋酸菌。
17.上述重组醋酸菌在醋酸发酵中的应用。
18.进一步地，醋酸发酵包括液态表面静置食醋发酵；
19.优选地，醋酸发酵的产品包括饮料醋或调味品醋。
20.一种醋酸发酵方法，将上述重组醋酸菌作为发酵菌进行发酵生产醋酸。
21.进一步地，发酵的原料包括水果、高粱、玉米、小麦或土豆；
22.优选地，醋酸发酵的产品包括饮料醋或调味品醋。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
24.本发明提供的重组醋酸菌是采用巴氏醋杆菌中醋酸耐受蛋白groesl的启动子作为粘(深)红酵母(rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal的启动子，实现苯丙氨酸解氨酶在醋酸菌中表达。该重组醋酸菌中醋酸耐受蛋白groesl的启动子核苷酸序列如seq id no.1所示，苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，该启动子可以协同苯丙氨酸解氨酶的表达，大幅度的提高苯丙氨酸解氨酶基因的转录水平，有效增强了能量代谢和氨代谢水平，实现增加菌株胞内铵离子浓度，从而缓解ph变化，提高重组醋酸菌的酸耐受性。同时，重组醋酸菌进行醋酸发酵具有发酵迟缓期短，发酵速率高等优点，从而减少能源消耗、提高生产效率、提高企业效益。此外，苯丙氨酸解氨酶脱氨反应生成的反式肉桂酸，作为一种香料，具有很好的保香作用，可以改善食醋的风味。
25.因此，本发明提供的重组醋酸菌可以作为醋酸发酵工业中的发酵菌，可以提高产品的酸度同时改善产品的风味。例如生产饮料醋和调味品醋。
26.本发明提供的重组醋酸菌的制备方法通过采用基因工程的手段将启动子为seq id no.1的苯丙氨酸解氨酶(seq id no.3)在醋酸菌中实现表达，在醋酸菌改造的方法中该方法操作简单，重现性好，成本低。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为实施例1中质粒pbbr1-pgro-pal酶切产物琼脂糖凝胶电泳，其中，m：marker；1、2：质粒pbbr1-pgro-pal用ecor v和cla i双酶切；
29.图2为实施例2中原始菌株与重组菌株的醋酸耐受性影响；
30.图3为实施例2中原始菌株与重组菌株胞内铵离子含量比较；
31.图4为实施例3中液态表面静置发酵食醋发酵过程曲线。
具体实施方式
32.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
33.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
34.本发明提供一种重组醋酸菌，为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌，其中，苯
丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为seq id no.1所示的核苷酸序列。
35.发明人首次将苯丙氨酸解氨酶引入醋酸菌中，通过调节生物脱氨途径来缓解胞内ph变化从而提高菌体的耐酸性并且提高菌体的发酵效率。其中，启动子来源于巴氏醋杆菌中醋酸耐受蛋白groes的启动子，该启动子来源于醋酸菌，所以可以最大程度的提高苯丙氨酸解氨酶的表达量同时降低对宿主菌体的刺激反应；苯丙氨酸解氨酶来源于粘(深)红酵母(rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal，经实验发现该重组醋酸菌可以提高菌株耐酸性，同时提高产酸速率。
36.ccttggcaaagttttcacaaacctgccgaatatggtggttcacaccaaaaatttcctgcagcaccacaagtgtgtaaggatgatggctgccttcggtttcccatgcagaaaactcatgtccatctgcggcctgaagtgttgtgatatgacccatgtaagcacctcctatgtgctctcaggttacagcaaaaagaaactttatccacattccttgactctgcctttgggcagacctatctccttttctggcactcccggggtgggagtgctaacgtaacgcggcgttatgttacgcgcgacaaagcggatggggctgctttctgttaagggcaccatcccaaaaatgaatgtggagcgatccata(seq id no.1)。
37.maeeitlytsdspakhltvsravlaahstvfrdllsiptsapdvadpahkdcsvavaeteaeikpflsiltgefdeplelsedewkdvarradkydskvarglvenkvrastndesadfalnlayhtrddalltsaafhvlrledanpnlleeerksltelikqdlarwkpmlrehalgigyhdapqylsscasgsctrlsaelawyrgvhkalaagsaktsktetkffapfrrkieeaaqerdvrlcalhreglcrearefeeefyrktappfpr(seq id no.3)。
38.在优选地实施方式中，醋酸菌将乙醇氧化为醋酸。由于现有技术中大部分的醋酸发酵菌株均是以乙醇为原料，所以选用以乙醇为原料氧化得到醋酸的醋酸菌作为宿主菌株可以实现现有生产工艺中发酵菌株的普遍改造。
39.在优选地实施方式中，醋酸菌包括葡糖杆菌、醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，优选为醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，进一步优选为醋化醋杆菌或巴氏醋杆菌，更进一步优选为巴氏醋杆菌cgmcc 3089或巴氏醋杆菌nbrc 3283。
40.在优选地实施方式中，苯丙氨酸解氨酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。更具体地，启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因通过重组载体导入醋酸菌，重组载体的骨架载体优选为质粒pbbr1p264(verena kallnik,maria meyer,uwe deppenmeier,et al.construction of expression vectors for protein production in gluconobacter oxydans.journal of biotechnology 150(2010)460
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465)。该质粒可以在醋酸菌中稳定复制。
41.atggccgaagaaatcacactgtacaccagcgactccccggcgaaacaccttacagtcagccgggccgtccttgccgcgcattccacagtgttccgcgatctgctgagcattccgacaagcgcgccagatgtcgcggatccagcgcataaagattgcagcgtcgcggtggccgaaaccgaagcggaaatcaagccgtttctgtccattctgaccggcgaattcgatgaaccgctggaactgagcgaggatgagtggaaagacgtggcgcggcgggcggataaatacgacagcaaagtggcccgggggctggtggaaaacaaagtgcgggcgagcacaaacgatgaatccgccgacttcgcgctgaatctggcgtaccatacacgggatgacgcccttctgacaagcgccgcgttccacgtgcttcggctggaagacgcgaacccaaatctgctggaggaagaacggaagtcgctgaccgagctgatcaaacaagatctggcccggtggaaaccgatgctgcgggaacatgcgctgggcatcggctaccatgatgccccgcagtatctgtccagctgtgcgagcgggagctgtacacgccttagcgcggaactggcgtggtatcggggcgtccataaagcccttgccgccgggagcgcgaaaacatccaagaccgaga
ccaagttcttcgcgccgttccggcgcaaaattgaggaagccgcgcaagaacgggatgtgcgcctttgtgcgctgcatcgggaaggcctttgtcgggaagcccgggagttcgaagaagagttctaccggaagaccgccccaccgttcccacggtga(seq id no.2)。
42.本发明同时提供一种重组醋酸菌的制备方法，将含有启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因的重组载体导入醋酸菌，得到重组醋酸菌。
43.优选地，制备方法可以为如下：
44.(1)以acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因组为模板，pcr扩增得到该菌株中的醋酸耐受蛋白groesl的启动子基因(引物如下)。与pbbr1p264质粒构建重组质粒pbbr1-pgro。
45.pgro-1：tcgatatcccttggcaaagttttcacaaac(seq id no.4)，下划线表示ecor v酶切位点；
46.pgro-2：gtatcgattatggatcgctccacattcatt(seq id no.5)，下划线表示cla i酶切位点。
47.(2)利用基因合成的方法获得来源于粘(深)红酵母(rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal，并将其连接到上述pbbr1-pgro质粒中，获得重组质粒pbbr1-pgro-pal。
48.(3)将重组质粒pbbr1-pgro-pal转化到acetobacter pasteurianus cgmcc 3089中进行表达。
49.醋酸发酵方法可以参照如下：
50.(1)培养基的制备：
51.培养基中具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或乙醇等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)；培养基中苯丙氨酸浓度为0.2-1g/l；培养基中乙醇浓度为30-200g/l。
52.(2)种子培养：
53.利用250-1000ml的摇瓶，装有如上所述培养基30-100ml，接入含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的基因工程醋酸菌进行摇瓶培养，摇床转速为100-300转/分钟，温度为27-30℃，培养时间为20-30小时，制备种子液。
54.(3)醋酸发酵：
55.本发明的基因工程醋酸菌可应用于以乙醇或含有乙醇的酒醪为原料发酵生产食醋或者醋酸。
56.本发明同时提供重组醋酸菌在醋酸发酵中的应用。醋酸发酵的产品包括饮料醋或调味品醋。发酵的原料包括水果、高粱、玉米、小麦或土豆。
57.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
58.本发明涉及的引物的制备、pcr反应、核苷酸片段的纯化、回收、酶切、连接、dna导入、核苷酸序列人工合成等操作是本领域技术人员所熟知的，可以依据例如《分子克隆实验指南》(科学出版社，第四版，2017年)中记载的方法，或按照制造厂商所建议的条件来实施。
59.实施例1含有重组质粒pbbr1-pgro-pal巴氏醋杆菌基因工程菌的构建
60.1.1醋酸耐受蛋白groesl启动子pgro序列扩增
61.引物序列如下：
62.pgro-1：tcgatatcccttggcaaagttttcacaaac(seq id no.4)
63.pgro-2：gtatcgattatggatcgctccacattcatt(seq id no.5)
64.表1 pcr反应体系的组成
[0065][0066]
pcr反应条件为：
①
98℃预变性30s；
②
98℃ 10s；
③
72℃时间根据靶基因长度而定，扩增速度为20-30kb/s，
②
～
③
30个循环；
④
72℃ 2min；
⑤
4-10℃保温。
[0067]
以提取的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)总dna作为模板，扩增目的基因pgro序列。将扩增的pcr产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。使用omega gel extraction试剂盒回收pcr扩增产物，用核酸分析仪检测dna的浓度及纯度。
[0068]
1.2质粒载体线性化及重组质粒pbbr1-pgro-pal构建
[0069]
将e.coli dh5α/pbbr1p264菌液从甘油管按照1％接种量转接与5ml含有50μg/ml卡那霉素的ypg试管中，200r/min，37℃过夜振荡培养。12000r/min离心收集菌液，取菌体沉淀，使用omega质粒提取试剂盒提取质粒。
[0070]
采用合适的限制性内切酶对pbbr1p264质粒与回收后pcr目的产物进行双酶切，37℃酶切反应90min。将酶切纯化后的载体质粒和目的片段按1:3(物质的量之比)的比例进行连接反应(16℃，12小时)；连接产物转入大肠杆菌dh 5α，经筛选获得重组质粒pbbr1-pgro。
[0071]
1.3重组质粒pbbr1-pgro-pal的构建
[0072]
利用基因合成的方法获得来源于粘(深)红酵母(rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal(seq id no.5)，并将其连接到可在醋酸菌中稳定复制的质粒pbbr1-pgro中，获得重组质粒pbbr1-pgro-pal。双酶切验证结果如图1所示。
[0073]
1.4巴氏醋杆菌的电转化实验
[0074]
将验证成功的重组质粒电转化至简单节杆菌感受态中，涂布到含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的ypg固体平板中，30℃倒置培养48小时，获得含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因工程菌。从ypg固体平板上挑取转化子接种于含有50μg/ml卡那霉素抗性的ypg试管培养基中，培养18-24h，收集菌体并提取质粒，进行质粒pcr验证。利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测质粒pcr产物。将验证正确的工程菌存于-80℃备用。
[0075]
实施例2重组质粒pbbr1-pgro-pal的基因工程醋酸菌关键理化检测
[0076]
2.1耐受性检测
[0077]
培养基组成：酵母膏15g/l，葡萄糖20g/l，苯丙氨酸浓度为0.5g/l，其余为水。
[0078]
分别接种含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的醋酸菌和原始菌株于含有1％(v/v)醋酸浓度的培养基中，并调整初始od
600
一致。分别于24h、48h取样比较两者生长情况。含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因工程菌和原始菌株acetobacter pasteurianus cgmcc 3089耐受性比较结果如图2。
[0079]
2.2胞内铵离子含量检测
[0080]
同时选取1％的醋酸、48h条件下采用水杨酸分光光度法对菌体胞内铵离子含量进行测定。使用1
×
pbs缓冲液洗涤菌体后向菌体添加高效ripa组织/细胞快速裂解液进行超声破碎。取8ml样品于10ml比色管中，加入1ml显色剂(水杨酸-酒石酸钾钠溶液)、2滴亚硝基铁氰化钠(0.01g/ml)和2滴次氯酸钠(有效氯3.5g/l、游离碱浓度0.75mol/l)使用液，加水稀释至标线，混匀后显色60min。以水为空白参比，用10mm比色皿检测在697nm处吸光度。根据标准曲线检测原始菌株和重组菌株的胞内铵离子的含量。结果如图3所示。
[0081]
2.3总酚含量检测
[0082]
标准曲线的绘制：分别吸取不同浓度的没食子酸0.2ml于10ml具塞比色管中，加入0.8ml福林酚试剂，混匀，反应5min，之后加入1.5ml碳酸钠溶液(10％)，加入去离子水至10ml，室温反应2h，测定波长765nm处吸光度值，整个实验避光进行。以没食子酸含量为横坐标，a
765
为纵坐标，绘制标准曲线。
[0083]
样品测定：样品经稀释后量取0.2ml于10ml具塞比色管中，然后按照标曲测定操作，利用标曲计算样品中总酚含量，结果以mggae/ml表示。
[0084]
实施例3利用含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的醋酸菌液态表面静置发酵生产食醋
[0085]
3.1制备种子液
[0086]
从斜面取含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因工程菌于种子培养基中，在30℃，160转/分钟条件下摇床培养25小时。按10％(v/v)的接种量转接入新鲜的种子培养基中进行放大培养。种子培养基组成：酵母膏15g/l，葡萄糖20g/l，乙醇3.5％(v/v)，苯丙氨酸浓度为0.5g/l，其余为水。
[0087]
3.2酒精发酵
[0088]
称取粉碎后的高粱1kg，倒入糊化桶中，加烧开的水至淹没高粱。加入耐高温α-淀粉酶220μl并搅拌均匀。在85-100℃条件下加热30-40min，使高粱糊化。加热结束后自然降温至55℃左右，加入固体糖化酶23g，搅拌均匀后保温1h进行糖化。糖化结束后加入0.65kg大曲，装入发酵用坛子中，加水补重量至5kg。加入3g酵母，并搅拌均匀。液封后放入28℃培养箱中，发酵约7-9d。
[0089]
3.3醋酸发酵
[0090]
醋酸发酵开始前，补充一部分酒精，使酒精浓度达到8％(v/v)左右。在酒醪中加入活化后的醋酸菌，接种量为10％，发酵温度维持30℃，初始醋酸浓度10g/l，醋酸发酵过程采用液体表面静置发酵法。
[0091]
利用原始菌株acetobacter pasteurianus cgmcc 3089在30℃条件下，48h取样一次，28d发酵结束，醋酸终浓度为82g/l，乙醇转酸率约为87.7％，平均产酸速率约为2.43g/(l
·
d)，测得总酚含量为0.94mg/ml，其中反式肉桂酸含量为0.12mg/l。
[0092]
利用含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因工程菌在30℃条件下，48h取样一次，24d发酵结束，醋酸终浓度为87g/l，则乙醇转酸率约
为93.5％，平均产酸速率约为3.21g/(l
·
d)，测得总酚含量为1.23mg/ml。
[0093]
图4为含有重组质粒pbbr1-pgro-pal的acetobacter pasteurianus cgmcc 3089基因工程菌和原始菌株醋酸发酵比较。
[0094]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。