一种基于CRISPR技术的集成检测芯片和检测方法与流程

一种基于crispr技术的集成检测芯片和检测方法
技术领域
1.本发明属于在生物检测的领域，具体涉及一种基于crispr技术的集成检测芯片和检测方法。


背景技术：

2.目前，核酸检测主要的操作是，采取咽拭子、鼻拭子或血液样本，取样后，做病毒核酸的实验室检测：提取标本中的rna，并逆转成cdna，用病毒cdna的特异性引物进行pcr扩增。如果扩增的产物，出现病毒特异性的dna，则病毒核酸检测结果为阳性。利用pcr检测技术进行核算检测反应时间需要4-6个小时，检测时间长，在pcr检测的过程中扩增是非常重要的环节，pcr扩增分包含变性、退火、延伸三个过程，其中变性过程需要将温度控制在94℃，退火和延伸过程需要将温度控制在55℃，三个过程循环进行，循环一次需要2-4分钟，扩增时间需要持续3-4个小时。由于扩增过程对温度的要求比较严格，同时采用的都是非封闭式的检测形式，对实验室的环境要求严格，对专业设备和操作人员的专业能力要求也比较高，导致综合成本较高。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于crispr技术的集成检测芯片和检测方法，解决了核酸检测持续时间长、成本高并且高度依赖实验室环境的问题。
5.为了实现上述目的，本发明提供的一种基于crispr技术的集成检测芯片，包括尺寸匹配的圆形检测芯片上层和圆形检测芯片下层，所述检测芯片下层上围绕圆心圆周布置有多个检测通道，所述检测通道上自所述检测芯片下层的圆心起依次设有通过流道相连接的检测样本位、第一试剂位、第一微流路、第二试剂位、第二微流路、第三试剂位、第三微流路、检测位、第四微流路和废液仓；
6.检测时，将检测样本注入所述检测样本位内，通过离心控制所述检测样本在所述检测通道上流动。
7.进一步地，所述圆形检测芯片上层上对应所述检测样本位的位置处设有加样孔，用于将所述检测样本加入到所述检测样本位内。
8.优选地，所述第一试剂位、第二试剂位、第三试剂位和检测位内预埋检测试剂。
9.优选地，多个所述检测通道的多个所述检测样本位重合位于所述检测芯片下层的圆心处形成单样本检测样本位，所述单样本检测样本位外围绕圆环形样本分配器，所述单样本检测样本位、所述圆环形样本分配器与多个所述检测通道均通过流道连通。
10.进一步地，所述检测芯片上层的圆心处设有单样本加样孔，所述单样本加样孔的位置与所述单样本检测样本位的位置相对应，所述单样本加样孔的圆心与所述单样本检测样本位的圆心在竖直方向上重合。
11.优选地，所述基于crispr技术的集成检测芯片为目标核酸全封闭式现场一体化检
测体系。
12.本发明还提供一种基于crispr技术的集成检测方法，使用上述的基于crispr技术的集成检测芯片完成。
13.进一步地，包括以下步骤：
14.(1)采集样品，加入样本保存液，得到检测样本；
15.(2)将所述检测样本通过所述加样孔注入所述检测样本位中，所述检测样本通过流道流入所述第一试剂位，所述检测样本进行核酸释放；
16.(3)对所述基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，所述检测样本通过所述第一微流路进入所述第二试剂位，所述检测样本进行核酸扩增反应；
17.(4)扩增完成后，对所述基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，所述检测样本通过所述第二微流路进入所述第三试剂位，进行聚合反应形成具有剪切活性的复合物；
18.(5)聚合反应完成后，对所述基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，所述检测样本通过所述第三微流路进入所述检测位，所述检测样本内形成的具有剪切活性的复合物，非特异性剪切报告dna或报告rna，释放荧光信号；
19.(6)通过光电检测系统完成荧光信号采集，进行定量或定性检测。
20.进一步地，还包括步骤：
21.(7)完成检测后，对所述基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，所述检测样本通过所述第四微流路进入所述废液仓。
22.优选地，所述第一试剂位预埋核酸释放试剂，所述第二试剂位预埋核酸扩增试剂，所述第三试剂位预埋聚合反应试剂，检测位内预埋报告dna或报告rna。
23.本发明提供的一种基于crispr技术的集成检测芯片和检测方法，具有如下有益效果：
24.1、提高了样品检测速度，单组样品的检测时间缩短为40分钟以内；
25.2、采用的是常温扩增的方式，可以大大降低核酸检测对设备的要求，可使检测设备的成本下降50％以上，并且可以实现检测设备的小型化；
26.3、基于crispr技术的集成检测芯片设计为圆形，可以围绕中心圆周布置多个检测通道，能够一次操作步骤，完成多组检测，可以完成单项目的多次检测减小误差，也可以同时完成多种不同项目的检测，检测效率高出很多倍；
27.4、形成了采样、提取、检测封闭式一体化体系，实现了目标核酸现场快速检测。
附图说明
28.图1为本具体实施方式中的检测芯片上层和检测芯片下层的结构示意图。
29.图2为实施例1中检测芯片上层的结构示意图。
30.图3为实施例1中检测芯片下层的结构示意图。
31.图4为实施例1中的检测通道的结构示意图。
32.图5为实施例2中的检测通道的结构示意图。
33.图6为实施例2中检测芯片上层的结构示意图。
34.图7为实施例2中检测芯片下层的结构示意图。
35.图中：
36.1、检测芯片上层，2、检测芯片下层，3、单样本加样孔，4、样本分配器，5、检测通道，6、多样本加样孔，7、检测样本位，8、第一试剂位，9、第一微流路，10、第二试剂位，11、第二微流路，12、第三试剂位，13、第三微流路，14、检测位，15、第四微流路，16、废液仓，17、单样本检测样本位。
具体实施方式
37.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
38.一种基于crispr技术的集成检测芯片，利用crispr技术，可以在常温环境下进行dna或rna的集成检测，同时将检测时间从4-6个小时缩短至40分钟以内，可以实现单样本多项目同时检测，也可以实现多样本单项目高通量检测或者多样本多项目同时检测。
39.实施例1针对单样本的基于crispr技术的集成检测芯片
40.如图1-4所示，基于crispr技术的集成检测芯片，分为检测芯片上层1和检测芯片下层2两部分，检测芯片上层1和检测芯片下层2为两个尺寸匹配的圆形结构。
41.检测芯片上层1的圆心处设有单样本加样孔3，检测芯片下层2上在圆心位置处设有附带圆环形样本分配器4的单样本检测样本位17，单样本检测样本位17与单样本加样孔3的位置上下对应，使检测芯片上层1和检测芯片下层2闭合状态下，单样本检测样本位与单样本加样孔3的位置上下重合，使样本从单样本加样孔3直接加入到单样本检测样本位17中。
42.检测芯片下层2上在圆心位置处设有附带圆环形样本分配器4的单样本检测样本位17。检测芯片下层2上围绕该单样本检测样本位4圆周布置有一个或多个检测通道5，检测通道5自检测芯片下层2上样本分配器4圆环外沿起始至邻近检测芯片下层2的边沿终止，每个检测通道5上自样本分配器4圆环外沿起依次设有通过流道相连接的第一试剂位8、第一微流路9、第二试剂位10、第二微流路11、第三试剂位12、第三微流路13、检测位14、第四微流路15和废液仓16。单样本检测样本位4与各个检测通道5通过流道相连接。第一微流路9的作用是在无外力作用下，使第一试剂位8与第二试剂位10之间的液体不流通；第二微流路11的作用是在无外力作用下，使第二试剂位10与第三试剂位12之间的液体不流通；第三微流路13的作用是在无外力作用下，使第三试剂位12与检测位14之间的液体不流通；第四微流路15的作用是在无外力作用下，使检测位14与废液仓16之间的液体不流通。
43.检测芯片上层1和检测芯片下层2通过注塑、光刻、腐蚀或压印等工艺均可制作，制作完成后对检测芯片下层2进行化学改良，同时可以在检测芯片下层2中预埋试剂。检测芯片上层1和检测芯片下层2的加工材料可以使用玻璃、聚二甲基硅氧烷(英文简称pdms)、聚碳酸酯(英文简称pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(英文简称pmma)中的任意一种或多种，检测芯片上层1和检测芯片下层2可通过超声、激光、溶液或热等多种方式实现键合封装。
44.在检测芯片下层2中预埋试剂的情况下，第一试剂位8、第二试剂位10和第三试剂位12分别预埋核酸释放试剂、核酸扩增试剂和聚合反应试剂，检测位14预埋报告dna或报告rna。聚合反应试剂为向导rna和cas蛋白，向导rna和cas蛋白与目标核酸结合后形成复合物。
45.基于crispr技术的集成检测方法，针对单样本单项目或多项目进行检测时，使用
针对单样本的基于crispr技术的集成检测芯片，包括以下步骤：
46.1、检测芯片下层2的每个检测通道5上的第一试剂位8、第二试剂位10、第三试剂位12和检测位14分别添加相应试剂。
47.第一试剂位8上添加了核酸释放试剂，使检测样本进行核酸释放。
48.第二试剂位10上添加了核酸扩增试剂，使检测样本进行核酸扩增反应。
49.第三试剂位12上添加了聚合反应试剂，即向导rna与cas蛋白，与检测样本内特定核酸片段聚合成具有剪切活性的复合物。
50.检测位14上添加信号报告试剂，进入检测位14的具有剪切活性的复合物，非特异性剪切报告dna或报告rna，释放荧光信号，通过光电检测系统完成荧光信号采集，进行定量或定性检测。
51.2、检测芯片上层1和检测芯片下层2进行封装。
52.检测芯片下层2的每个检测通道5的第一试剂位8、第二试剂位10、第三试剂位12和检测位14在预埋试剂的情况下，可以提前封装完成，直接使用基于crispr技术的集成检测芯片的成本进行下述步骤。
53.3、采集样品，加入样本保存液，得到检测样本，目标检测物为dna或rna。
54.4、将上一步得到的检测样本从单样本加样孔3加入，检测样本进入到单样本检测样本位4，单样本检测样本位4与各个检测通道5通过流道相连接，检测样本从单样本检测样本位4到达第一试剂位8，检测样本进行核酸释放。
55.5、根据检测项目与检测样本的形式，对基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，通过离心力的作用，检测样本从第一试剂位8通过第一微流路9进入第二试剂位10，在第二试剂位10处，检测样本完成核酸常温扩增，用时10-20分钟。
56.6、上一步骤核酸扩增完成后，对基于crispr技术的集成检测芯片进行第二次离心，通过离心力的作用，扩增完成的检测样本通过第二微流路11进入第三试剂位12，核酸扩增完成的检测样本在第三试剂位12完成聚合反应，得到具有剪切活性的复合物。
57.7、对基于crispr技术的集成检测芯片进行第三次离心，通过离心力的作用，通过第三微流路13进入检测位14，在检测位14报告核酸被非特异性切断，报告核酸两端的淬灭剂与荧光素分离，荧光素发出荧光。
58.8、通过光电检测系统完成荧光信号采集，从而完成定量或定性检测。
59.9、完成检测后，对基于crispr技术的集成检测芯片进行第四次离心，通过离心力的作用，试剂通过第四微流路15进入废液仓16。
60.基于crispr技术的集成检测方法进行核酸检测，极大的提高了样品检测速度，与pcr方法相比，单组样品的检测时间可从4-6小时缩短为40分钟以内。基于crispr技术的集成检测芯片采用的是常温扩增及全封闭式一体化检测体系的方式，可以大大降低核酸检测对设备和实验室环境的要求，降低对操作人员的专业要求，可使检测设备的成本下降50％以上，并且可以实现检测设备的小型化。
61.基于crispr技术的集成检测芯片设计为圆形，可以围绕中心圆周布置多个检测通道5，能够一次操作步骤，完成多组检测，可以完成单项目的多次检测减小误差，也可以同时完成多种不同项目的检测，检测效率高出很多倍。
62.实施例2针对多样本的基于crispr技术的集成检测芯片
63.如图5-7所示，基于crispr技术的集成检测芯片，分为检测芯片上层1和检测芯片下层2两部分，检测芯片上层1和检测芯片下层2为两个尺寸匹配的圆形结构。
64.检测芯片上层1围绕圆心圆周布置多个多样本加样孔6，检测芯片下层2上在与多样本加样孔6的对应位置处设有检测样本位7，使检测芯片上层1和检测芯片下层2闭合状态下，多样本加样孔6与检测样本位7的位置上下重合，使样本从多样本加样孔6直接加入到检测样本位7中。
65.检测芯片下层2上围绕圆心圆周布置有一个或多个检测通道5，每个检测通道5自检测样本位7起依次设有通过流道相连接的第一试剂位8、第一微流路9、第二试剂位10、第二微流路11、第三试剂位12、第三微流路13、检测位14、第四微流路15和废液仓16。检测样本位7与第一试剂位8通过流道相连接。第一微流路9的作用是在无外力作用下，使第一试剂位8与第二试剂位10之间的液体不流通；第二微流路11的作用是在无外力作用下，使第二试剂位10与第三试剂位12之间的液体不流通；第三微流路13的作用是在无外力作用下，使第三试剂位12与检测位14之间的液体不流通；第四微流路15的作用是在无外力作用下，使检测位14与废液仓16之间的液体不流通。
66.检测芯片上层1和检测芯片下层2通过注塑、光刻、腐蚀或压印等工艺均可制作，制作完成后对检测芯片下层2进行化学改良，同时可以在检测芯片下层2中预埋试剂。检测芯片上层1和检测芯片下层2的加工材料可以使用玻璃、聚二甲基硅氧烷(英文简称pdms)、聚碳酸酯(英文简称pc)或聚甲基丙烯酸甲酯(英文简称pmma)中的任意一种或多种，检测芯片上层1和检测芯片下层2可通过超声、激光、溶液或热等多种方式实现键合封装。
67.在检测芯片下层2中预埋试剂的情况下，第一试剂位8、第二试剂位10、第三试剂位12、检测位14分别预埋核酸释放试剂、核酸扩增试剂、向导rna与cas蛋白、报告dna或报告rna。
68.针对多样本的基于crispr技术的集成检测芯片，也可以用于单样本的检测。
69.基于crispr技术的集成检测方法，针对多样本单项目或多项目进行检测时，使用针对多样本的预埋试剂的基于crispr技术的集成检测芯片，包括以下步骤：
70.1、采集样品，加入样本保存液，得到检测样本，目标检测物为dna或rna。
71.2、将上一步得到的检测样本从多样本加样孔6加入，检测样本进入到检测样本位7，检测样本位7与第一试剂位8通过流道连接，检测样本从检测样本位7到达第一试剂位8，检测样本进行核酸释放。
72.3、根据检测项目与检测样本的形式，对基于crispr技术的集成检测芯片进行离心，通过离心力的作用，检测样本从第一试剂位8通过第一微流路9进入第二试剂位10，在第二试剂位10处，检测样本完成核酸常温扩增，用时10-20分钟。
73.4、上一步骤核酸扩增完成后，对基于crispr技术的集成检测芯片进行第二次离心，通过离心力的作用，扩增完成的检测样本通过第二微流路11进入第三试剂位12，核酸扩增完成的检测样本在第三试剂位12完成聚合反应，得到具有剪切活性的复合物。
74.5、对基于crispr技术的集成检测芯片进行第三次离心，通过离心力的作用，通过第三微流路13进入检测位14，在检测位14报告核酸被非特异性切断，报告核酸两端的淬灭剂与荧光素分离，荧光素发出荧光。
75.6、通过光电检测系统完成荧光信号采集，从而完成定量或定性检测。
76.7、完成检测后，对基于crispr技术的集成检测芯片进行第四次离心，通过离心力的作用，试剂通过第四微流路15进入废液仓16。
77.基于crispr技术的集成检测芯片设计为圆形，可以围绕中心圆周布置多个检测通道5，能够一次操作步骤，完成多组检测，可以完成多样本单项目的多次检测，也可以同时完成多样本的多种不同项目的检测，检测效率高出很多倍。
78.本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。