一种兼具抗氧化及ACE抑制功能多肽及制备方法和用途

一种兼具抗氧化及ace抑制功能多肽及制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于农产品精深加工技术领域，具体为一种兼具抗氧化及ace抑制功能多肽及制备方法和用途。


背景技术：

2.人类的很多疾病与体内自由基的产生密切相关，这些自由基通过攻击机体组织，造成dna，蛋白质和膜脂质的氧化损伤，引发一系列的链反应，进而损伤机体的各项器官，造成代谢性损伤。因此寻找新型抗氧化剂，具有重要意义。
3.目前治疗高血压的药物，如卡托普利，可以有效地抑制ace的活性,降低血压,但是其有明显的副作用，长期服用会导致降压过度、泌尿系统病变、咳嗽、味觉失真及血管神经性水肿等。因此，ace抑制剂研究应运而生。ace抑制剂来源天然，毒性小，吸收好，为治疗高血压提供了另一条出路，目前，ace抑制剂的研究主要集中在大豆，玉米，海鲜等方面，而关于食用菌子实体分离纯化ace抑制肽，较少。
4.食用菌因其具有丰富的营养价值，近几年来，越来越受到科研工作者的重视。随着研究的深入，食用菌多糖诸多生物活性已逐渐被人们认知，如抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节肠道菌群、抗疲劳、降血糖、降血脂等。蛋白活性主要集中在抗炎，多肽抗氧化等方面，而关于食用菌多肽兼具抗氧化及ace抑制活性方面的报道几乎没有。金福菇(tricholoma lobayense)，担子菌门，伞菌纲，伞菌目，口蘑科，香菇属，又名大白口蘑，是一种正处于开发阶段的高温型珍稀食用菌，基于本实验室对金福菇多糖的研究发现tlh-3具有与vc活性相当的抗氧化效果并且无毒副作用。而在干重比例中，蛋白的含量仅次于多糖，目前对其研究主要集中于多糖及菌丝体蛋白的生物活性研究，关于子实体功能多肽的相关研究尚无报道，因此金福菇子实体蛋白具有广阔的研究前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种兼具抗氧化及ace抑制功能多肽及制备方法和用途。
6.本发明采用的技术方案如下：一种兼具抗氧化及ace抑制功能多肽的制备方法，所述兼具抗氧化及ace抑制功能多肽及其制备方法包括以下步骤：
7.s1:取干燥的金福菇子实体，用粉碎机打成粉末；
8.s2:控制料液比为1:15加入5％的冰醋酸；
9.s3:控制温度为4℃过夜后加入按体积的80％的硫酸铵，放置4℃冰箱中12h；
10.s4:之后于超高速离心机中4℃以15000
×
g的转速离心15min得到沉淀；
11.s5:用3500da的透析袋透析掉无机盐离子，冻干即为蛋白样品；
12.s6:提取的蛋白样品，加入酶，调节缓冲液的ph，酶解时间及温度得到相应的水解样品；
13.s7:取步骤s5中制得的样品进行分离纯化，用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到
5000da以下的样品，而后进行液相进行纯化样品。
14.在一优选的实施方式中，所述步骤s1中，5％的冰醋酸中含有0.1％的β-巯基乙醇。
15.在一优选的实施方式中，所述步骤s6中，酶的为丝氨酸蛋白酶，包括但不限于地衣杆菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶。
16.在一优选的实施方式中，所述步骤s6中加入酶的量为4％～8％；所述的缓冲液ph为8.5～10.5。
17.在一优选的实施方式中，所述步骤s6中酶解时间为3～7小时，酶解温度为40℃～60℃。
18.在一优选的实施方式中，所述步骤s7中制得的功能多肽为金福菇功能多肽。
19.在一优选的实施方式中，所述功能多肽为的用途为在抗氧化及ace活性抑制方面的应用。
20.在一优选的实施方式中，所述功能多肽为的用途为在抗氧化及ace活性抑制方面的应用多肽分子量范围为0.8-1.2kda。
21.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
22.1、本发明中，本发明以金福菇子实体为原料，分离纯化出一种功能性多肽，步骤简单，效率高。
23.2、本发明中，通过体外清除自由基实验发现多肽具有很好的抗氧化活性；通过对ace抑制实验发现，具有较高的抑制活性。目前查阅资料中，尚未发现该金福菇功能多肽活性的相关报道，其在医药前景十分广阔。
附图说明
24.图1为本发明不同实施例及对比例获得的金福菇功能多肽抗氧化性对比图；
25.图2为本发明不同实施例及对比例获得的金福菇功能多肽ace抑制活性对比图。
具体实施方式
26.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
27.参照图1-2，
28.实施例1：
29.提取蛋白配成10mg/ml溶液，用naoh调ph值为9。根据质量比添加7％酶，置于45℃中，酶解4h。煮沸浴灭活5min，冷却。用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后利用液相色谱进行样品纯化，获得金福菇功能多肽。高效液相色谱分析其分子量约为924da，其对dpph和abts自由基的清除率分别为35.1％和23.1％，对ace的抑制率为43.6％。
30.实施例2：
31.提取蛋白配成10mg/ml溶液，用naoh调ph值为8.5。根据质量比添加5％酶，置于60℃中，酶解3h。煮沸浴灭活5min，冷却。用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后利用液相色谱进行样品纯化，获得金福菇功能多肽。高效液相色谱分析其分子量
约为1000da，其对dpph和abts自由基的清除率分别为19.2％和12.1％，对ace的抑制率为40％。
32.实施例3：
33.提取蛋白配成10mg/ml溶液，用naoh调ph值为10.5。根据质量比添加6％酶，置于50℃中，酶解5h。煮沸浴灭活5min，冷却。用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后利用液相色谱进行样品纯化，获得金福菇功能多肽。高效液相色谱分析其分子量约为1200da，其对dpph和abts自由基的清除率分别为26.5％和18.4％，对ace的抑制率为31.3％。
34.实施例4：
35.提取蛋白配成10mg/ml溶液，用naoh调ph值为10。根据质量比添加4％酶，置于55℃中，酶解7h。煮沸浴灭活5min，冷却。用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后利用液相色谱进行样品纯化，获得金福菇功能多肽。高效液相色谱分析其分子量约为760da,其对dpph和abts自由基的清除率分别为30％和20.5％，对ace的抑制率为60％。
36.实施例5：
37.产品的体外清除自由基能力：
38.(1)dpph自由基清除实验
39.在试管中加入2ml的不同浓度(50，100，200，400，800μg/ml)的金福菇多肽溶液，与2ml的dpph(0.13mol/l的甲醇溶液)，用振荡器混匀后放黑暗中静置30min，用517nm测定吸光值。3组平行并取吸光值的平均值进行计算。
40.按下面的方法计算清除率：
[0041][0042]
其中，a0为空白对照无样品；a1为样品本体吸光值；a2为实验组吸光值
[0043]
(2)abts自由基清除实验
[0044]
7.4mmol/l的abts与2.6mmol/l的k2s2o8溶液混合，在室温下避光放置12h，用缓冲液稀释直至其在a734 nm处的吸光值为0.7+0.02，即得abts+工作液。
[0045]
将样品配成一系列梯度浓度(50，100，200，400和800μg/ml)，取10μl溶液加200μl abts+上述溶液，于734nm处测定吸光值。阳性对照为vc，3组平行，吸光值的平均值计算分析。abts+的清除能力通过以下公式计算：
[0046][0047]
a0不加样品，只加abts的吸光值；ai为加入样品和abts的吸光值。
[0048]
实施例6：
[0049]
产品的抑制ace活性实验：
[0050]
(1)取40μl多肽溶液与40μl ace溶液，37℃保温5min。加入50μl hhl(5mmol/l)溶液，37℃水浴反应1h。然后200μl hcl终止反应。
[0051]
(2)反应液过滤，用c18分析柱进行分析，检测波长228nm。流动相为乙腈(0.1％tfa):超纯水(0.1％tfa)＝30％:70％
[0052]
(3)根据计算公式：
[0053]
ace抑制率的计算公式：
[0054][0055]
对比例1：
[0056]
金福菇蛋白样品的制备实例及相应活性
[0057]
(1)取干燥的金福菇子实体，用粉碎机打成粉末，料液比为1:15加入5％的冰醋酸(含有0.1％的β-巯基乙醇)，4℃过夜后加入按体积的80％的硫酸铵，放置4℃冰箱中12h，之后于超高速离心机中4℃以15000
×
g的转速离心15min得到沉淀，用3500da的透析袋透析掉无机盐离子，冻干即为蛋白样品。
[0058]
(2)提取的蛋白样品，加入7％酶，调节缓冲液的ph 9.5，酶解时间4h及温度45℃得到相应的水解样品。
[0059]
(3)取步骤(2)制得的样品进行分离纯化，用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后进行液相进行纯化样品，得到935da的肽。其对dpph和abts自由基的清除率分别为38.4％和26.2％，对ace的抑制率为62.1％。
[0060]
对比例2：
[0061]
》5000da样品的制备实例及相应活性
[0062]
(1)取干燥的金福菇子实体，用粉碎机打成粉末，料液比为1:15加入5％的冰醋酸(含有0.1％的β-巯基乙醇)，4℃过夜后加入按体积的80％的硫酸铵，放置4℃冰箱中12h，之后于超高速离心机中4℃以15000
×
g的转速离心15min得到沉淀，用3500da的透析袋透析掉无机盐离子，冻干即为蛋白样品。
[0063]
(2)提取的蛋白样品，加入7％酶，调节缓冲液的ph 9.5，酶解时间4h及温度45℃得到相应的水解样品。
[0064]
(3)取步骤(2)制得的样品进行分离纯化，用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以上的样品。其对dpph和abts自由基的清除率分别为23.3％和21.2％，对ace的抑制率为24％。
[0065]
工作原理：
[0066]
所述兼具抗氧化及ace抑制功能多肽及其制备方法包括以下步骤：
[0067]
s1:取干燥的金福菇子实体，用粉碎机打成粉末；
[0068]
s2:控制料液比为1:15加入5％的冰醋酸；
[0069]
s3:控制温度为4℃过夜后加入按体积的80％的硫酸铵，放置4℃冰箱中12h；
[0070]
s4:之后于超高速离心机中4℃以15000
×
g的转速离心15min得到沉淀；
[0071]
s5:用3500da的透析袋透析掉无机盐离子，冻干即为蛋白样品；
[0072]
s6:提取的蛋白样品，加入酶，调节缓冲液的ph，酶解时间及温度得到相应的水解样品；
[0073]
s7:取步骤s5中制得的样品进行分离纯化，用截留量5kda的超滤膜进行分离，得到5000da以下的样品，而后进行液相进行纯化样品，通过体外清除自由基实验发现多肽具有很好的抗氧化活性；通过对ace抑制实验发现，具有较高的抑制活性。目前查阅资料中，尚未
发现该金福菇功能多肽活性的相关报道，其在医药前景十分广阔，本发明以金福菇子实体为原料，分离纯化出一种功能性多肽，步骤简单，效率高。
[0074]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0075]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。