专利名称:甘蔗渣在发酵生产有机酸的固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域：
，涉及固定化纤维床反应器生产有机酸中，甘蔗渣作为固定化材料的应用。
背景技术：
有机酸是指一类在分子结构中具有羧基(-C00H)的化合物，在食品、饲料、塑料等领域具有广泛的应用前景。传统的有机酸生产方法主要以石油为原料采用化学合成法进行生产。当前，生物法制备有机酸由于产物天然、原料丰富等优点受到了越来越多的青睐。但是，目前有机酸发酵生产仍然存在很多问题。有机酸微生物发酵，如丙酸、乳酸、丁酸和琥珀酸发酵生产中普遍存在菌体生产缓慢、延滞期较长等问题。此外，在有机酸发酵生产过程中，代谢终产物(有机酸)的存在对菌体具有一定的抑制作用，限制了产物的进一步生成， 均不利于实现有机酸的高效生产。
传统的固定化方法主要采用凝胶包埋法，即将细胞包裹于海藻酸钠、卡拉胶、琼脂等凝胶中实现细胞的固定化生产。以固定化生产丙酸为例，Woskow SA等通过将丙酸杆菌固定于海藻酸钠中，经19 发酵，丙酸产量达47. Og/L,生产效率达0. 25g/L/h[1]，与游离细胞发酵相比(生产效率一般低于0. 10g/L/h)，具有一定的优势。但是，由于传质条件的限制，凝胶包埋法包埋的细胞难以实现自我更新，难以长时间保证菌体活力，并不适合活细胞发酵。此外，凝胶包埋的成本较高，不适用于有机酸的大规模生产。
近年来，以棉纤维作为固定化材料的棉纤维床反应器作为一种新型固定化方法受到了广泛关注。Yang ST等构建了一种外置式棉纤维床反应器，并将其成功用于包括丙酸、 乳酸和丁酸在内的多种有机酸的生产，取得了不错的结果。在以往的研究过程中，我们构建了一种内置式棉纤维床反应器(中国专利公开号CN101182457Am)并用于有机酸发酵，研究表明，该反应器是一种有效的有机酸生产方法，以丙酸为例，利用内置式棉纤维床反应器生产丙酸，发酵生产4%h，可产生约67. lg/L的丙酸(Yang ST等利用外置式棉纤维床反应器发酵生产900h，丙酸浓度达71. 2g/L[2])。此外，我们还以纱布、羊毛织物、涤纶织物作为固定化材料生产有机酸，均取得了不错的实验结果(中国专利公开号CN101182457A[3])。但是，为了更进一步提高有机酸生产效率，降低生产成本，仍然需要寻找更加天然、高效的固定化材料。
甘蔗渣作为制糖工业中甘蔗榨汁后剩余的废料，富含纤维结构，是一种天然的固定化材料，但到目前为止未见其作为固定化材料而应用于有机酸发酵的报道。此外，甘蔗渣自身仍含有部分蔗糖可作为碳源应用于有机酸发酵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供甘蔗渣作为固定化材料应用于有机酸发酵的新的应用价值。[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
甘蔗渣在发酵生产有机酸的固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用。
上述生产有机酸的固定化纤维床反应器既可以是内置式固定化纤维床反应器也可以是外置式固定化纤维床反应器。
上述有机酸为丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸。
发酵生产有机酸的内置式固定化纤维床反应器包括搅拌装置、反应器、内置固定化柱、PH自动控制装置和补料装置，搅拌装置悬于反应器中，内置固定化柱固定于反应器底部且不影响搅拌，粉碎后的甘蔗渣作为固定化材料填充于内置固定化柱中，PH自动控制装置和补料装置分别与反应器相连，反应器上部通过管路设置一个惰性气体入口和一个尾气出口。其中，所述的PH自动控制装置由PH探头、pH检测器、恒流泵、碱液瓶、空气过滤器及相互连接管路所构成，PH探头接于反应器上与反应器内的发酵液相接触，当反应器内pH低于所控PH值时，通过恒流泵将碱液瓶中的碱液补入反应器中自动控制pH，空气过滤器插在碱液瓶密封口处。其中，所述的补料装置由恒流泵、补料瓶、空气过滤器及相互连接的管路所构成，通过恒流泵将补料瓶中的培养基通过连接于反应器上的管路补入反应器内，空气过滤器插在补料瓶密封口处。
发酵生产有机酸的外置式固定化纤维床反应器包括搅拌装置、反应器、外置固定化柱、恒温水浴、PH自动控制装置和补料装置，搅拌装置悬于反应器中，外置固定化柱与反应器相连，外置固定化柱的温度由恒温水浴控制，以保持外置固定化柱内温度与反应器内温度一致，粉碎后的甘蔗渣作为固定化材料填充于外置固定化柱内，PH自动控制装置和补料装置分别与反应器相连，反应器上部通过管路设置一个惰性气体入口和一个尾气出口。 其中，所述的PH自动控制装置由pH探头、pH检测器、恒流泵、碱液瓶、空气过滤器及相互连接管路所构成，PH探头接于反应器上与反应器内的发酵液相接触，当反应器内pH低于所控 PH值时，通过恒流泵将碱液瓶中的碱液补入反应器中自动控制pH，空气过滤器插在碱液瓶密封口处。其中，所述的补料装置由恒流泵、补料瓶、空气过滤器及相互连接的管路所构成， 通过恒流泵将补料瓶中的培养基通过连接于反应器上的管路补入反应器内，空气过滤器插在补料瓶密封口处。
上述内置式或外置式固定化纤维床反应器中，碱液瓶中的碱液可以是3 8mol/L 的氢氧化钠或3 8mol/L碳酸氢钠水溶液；补料瓶中可以是碳源(葡萄糖、甘油等)及其他营养物质(氮源、无机盐等)；通入的惰性气体及排出的尾气为生产丙酸、乳酸或丁酸通入的惰性气体为氮气，尾气为氮气与二氧化碳的混合物，而生产琥珀酸时通入的惰性气体为二氧化碳，尾气为二氧化碳。
本发明中，丙酸生产菌株为常用的丙酸杆菌，如费氏丙酸杆菌NX_4(中国专利公开号CN101182457A，菌种保藏号CCTCC No.M207015)；所述的乳酸生产菌为乳酸杆菌，如鼠李糖乳杆菌ATCC 11443; 丁酸生产菌株为常用的丁酸羧菌，如酪丁酸羧菌ATCC 25755 ； 琥珀酸生产菌株为常用的琥珀酸放线杆菌，如琥珀酸放线杆菌ATCC55618。
利用上述内置式固定化纤维床反应器生产有机酸的方法为将丙酸、或乳酸、或丁酸、或琥珀酸的生产菌株接种于预先装有种子培养基的反应器中培养12 60h，即可实现菌株在内置固定化柱中甘蔗渣上的吸附，将反应器中的种子培养基换为发酵培养基，利用 PH自动控制装置补入碱液以控制反应器中的发酵液pH值，开动搅拌装置使反应器内物质充分接触，发酵生产相应的丙酸、或乳酸、或丁酸、或琥珀酸。
利用上述内置式固定化纤维床反应器生产有机酸的具体方法为将丙酸、或乳酸、 或丁酸、或琥珀酸生产菌株以5 20% (ν/ν)的接种量接种于预先分别装有相应种子培养基的反应器中，从惰性气体入口通入惰性气体，培养12 60h，实现菌株的吸附(即菌株固定在甘蔗渣上)。将反应器中的种子液替换为发酵培养基，从惰性气体入口通入惰性气体， 利用PH自动控制装置补入碱液，控制反应器中的发酵液PH值，同时利用搅拌装置(搅拌转速0 600r/min)实现反应器内物质的充分接触，实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸生产菌的固定化批式发酵。在培养一定时间后，当发酵液中的葡萄糖等底物基本消耗时，利用恒流泵从补料瓶补入葡萄糖等底物即可实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸的固定化补料发酵。在培养 12 60h后，还可将反应器中的种子液一次全部移出，补入相同体积的新鲜发酵培养基，实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸的固定化批式发酵。
利用上述外置式固定化纤维床反应器生产有机酸的方法为将丙酸、或乳酸、或丁酸、或琥珀酸生产菌株接种于预先装有种子培养基的反应器中培养12 60h，通过恒流泵将反应器中的菌株与外置固定化柱中的甘蔗渣充分接触，菌株吸附在甘蔗渣上实现菌株的固定化，将反应器中的种子液替换为发酵培养基，利用PH自动控制装置补入碱液以控制反应器中的发酵液PH值，开动搅拌装置使反应器内物质充分接触，发酵生产相应的丙酸、或乳酸、或丁酸、或琥珀酸。
利用上述外置式固定化纤维床反应器生产有机酸的具体方法为将丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸生产菌株以5 20% (ν/ν)的接种量接种于预先分别装有相应种子培养基的反应器中，从惰性气体入口通入惰性气体，培养12 60h，通过恒流泵将反应器中的菌株与外置固定化柱中的甘蔗渣充分接触，菌株吸附在甘蔗渣上实现菌株的固定化。将反应器中的种子液替换为发酵培养基，从惰性气体入口通入惰性气体，利用PH自动控制装置补入碱液以控制反应器中的发酵液PH值，同时利用搅拌装置(搅拌转速0-600r/min)实现反应器内物质的充分接触，实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸生产菌的固定化发酵。在培养一定时间后， 当发酵液中的葡萄糖等底物基本消耗时，利用恒流泵从补料瓶补入葡萄糖等底物即可实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸的固定化补料发酵。在培养12 60h后，还可将反应器中的种子液一次全部移出，补入相同体积的新鲜发酵培养基，实现丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸的固定化批式发酵。
与其他固定化材料相比，利用甘蔗渣作为固定化材料具有如下优势
1、细胞固定化成本极低固定化细胞所用的甘蔗渣为制糖工业中的废料，其作为固定化材料成本极低(市场价200 500元/吨)。一般的凝胶包埋法包埋材料较为昂贵 (如海藻酸钠，市场价26000 35000元/吨)，而以棉布、纱布、羊毛织物、涤纶织物等经人为加工的织物与甘蔗渣相比也是价格极高的。
2、细胞的高效吸附与不断更新甘蔗渣经粉碎后比表面积增大，细胞能够大量吸附在纤维表面与纤维间隙中，当细胞处于衰退期或菌体活力较差，难以附着于纤维表面，细胞将表现为自动脱落，空出的吸附位点可供高活力新鲜细胞重新吸附于甘蔗渣上，发酵菌株不会因为发酵批次过多而造成批次之间菌株活力的衰退，从而保证了批次发酵有机酸生产效率的稳定性。
发酵过程中，菌体活力与有机酸发酵密切相关。传统的凝胶包埋法细胞被包埋于凝胶中用于有机酸发酵，菌体随着发酵批次的增多自然衰退，活力降低。但是由于凝胶的束缚，处于衰退期的细胞仍滞留于细胞间隙中，不能自由进出，活力难以保证。而以包括棉纤维在内的织物作为固定化材料时细胞可以自由脱落与更新，但与甘蔗渣相比，前者的比表面积较小，吸附于纤维上细胞总量较甘蔗渣中稍少。
3、有机酸耐受性好、生产效率高有机酸对于菌体的发酵具有强烈的产物抑制作用，当有机酸达到一定浓度时产量将难以进一步提高，极大阻碍了有机酸的发酵。而以甘蔗渣为固定化材料的固定化纤维床反应器的有机酸生产效率远高于传统的凝胶包埋法，也高于目前报道中生产效率最高的外置式与内置式棉纤维床反应器(表1 表4)。以发酵生产丙酸为例，传统的凝胶包埋法生产的丙酸浓度难以突破50g/L(目前利用该方法生产丙酸浓度最高报道为47. Og/L,生产效率为0. 25g/L/h，见文献1)，而以棉纤维反应器丙酸发酵浓度难以突破75g/L(目前该方法生产丙酸最高报道为71. 2g/L，生产效率为0. 08g/L/h，见文献2)，而利用甘蔗渣作为固定化材料，在本研究过程中，利用外置式和内置式植物纤维床反应器丙酸浓度分别可高达132. 5g/L、124. lg/L，生产效率分别为0. 66g/L/h、0. 62g/L/h， 可见两种生产方法均为高效的丙酸生产方法。
表1.不同固定化方法生产丙酸比较
权利要求
1.甘蔗渣在发酵生产有机酸的固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用。
2.根据权利要求
1所述的应用，其特征在于甘蔗渣在发酵生产有机酸的内置式固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用。
3.根据权利要求
2所述的应用，其特征在于所述的发酵生产有机酸的内置式固定化纤维床反应器包括搅拌装置(9)、反应器(10)、内置固定化柱(11a)、pH自动控制装置和补料装置，搅拌装置(9)悬于反应器(10)中，内置固定化柱(Ila)固定于反应器(10)底部且不影响搅拌，粉碎后的甘蔗渣作为固定化材料填充于内置固定化柱(Ila)中，PH自动控制装置和补料装置分别与反应器(10)相连。
4.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的pH自动控制装置由pH探头(7)、pH 检测器(6)、恒流泵(5-1)、碱液瓶(2)、空气过滤器(1-1)及相互连接管路所构成，pH探头 (7)接于反应器(10)上与反应器(10)内的发酵液相接触，当反应器(10)内pH低于所控 PH值时，通过恒流泵(5-1)将碱液瓶(2)中的碱液补入反应器(10)中自动控制pH，空气过滤器(1-1)插在碱液瓶(2)密封口处。
5.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的补料装置由恒流泵(5-2)、补料瓶 (3)、空气过滤器(1-2)及相互连接的管路所构成，通过恒流泵(5-2)将补料瓶(3)中的培养基通过连接于反应器(10)上的管路补入反应器(10)内，空气过滤器(1-2)插在补料瓶 (3)密封口处。
6.根据权利要求
1所述的应用，其特征在于甘蔗渣在发酵生产有机酸的外置式固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用。
7.根据权利要求
6所述的应用，其特征在于所述的发酵生产有机酸的外置式固定化纤维床反应器包括搅拌装置(9)、反应器(10)、外置固定化柱(lib)、恒温水浴(13)、pH自动控制装置和补料装置，搅拌装置(9)悬于反应器(10)中，外置固定化柱(lib)与反应器(10) 相连，外置固定化柱(lib)的温度由恒温水浴(13)控制，以保持外置固定化柱(lib)内温度与反应器(10)内温度一致，粉碎后的甘蔗渣作为固定化材料填充于外置固定化柱(lib) 内，PH自动控制装置和补料装置分别与反应器(10)相连。
8.根据权利要求
7所述的应用，其特征在于所述的pH自动控制装置由pH探头(7)、pH 检测器(6)、恒流泵(5-1)、碱液瓶(2)、空气过滤器(1-1)及相互连接管路所构成，pH探头 (7)接于反应器(10)上与反应器(10)内的发酵液相接触，当反应器(10)内pH低于所控 PH值时，通过恒流泵(5-1)将碱液瓶(2)中的碱液补入反应器(10)中自动控制pH，空气过滤器(1-1)插在碱液瓶(2)密封口处。
9 根据权利要求
7所述的应用，其特征在于所述的补料装置由恒流泵(5-2)、补料瓶 (3)、空气过滤器(1-2)及相互连接的管路所构成，通过恒流泵(5-2)将补料瓶(3)中的培养基通过连接于反应器(10)上的管路补入反应器(10)内，空气过滤器(1-2)插在补料瓶 (3)密封口处。
10.根据权利要求
1 9中任意一项所述的应用，其特征在于所述的有机酸为丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸。
专利摘要
本发明公开了甘蔗渣在发酵生产有机酸的固定化纤维床反应器中作为固定化材料的应用。甘蔗渣作为固定化材料既可以应用于内置固定化纤维床反应器，也可应用于外置固定化纤维床反应器。本发明中，固定化细胞所用的甘蔗渣为制糖工业中的废料，其作为固定化材料成本极低。甘蔗渣经粉碎后比表面积增大，细胞能够大量吸附在纤维表面与纤维间隙中，当细胞处于衰退期或菌体活力较差时细胞会自动脱落，保证了吸附于纤维上的细胞活力。以甘蔗渣为固定化材料的固定化纤维床反应器的有机酸生产效率远高于传统的凝胶包埋法，也高于目前报道中生产效率最高的外置式与内置式其它植物纤维床反应器。
文档编号C12M1/36GKCN101402914 B发布类型授权 专利申请号CN 200810234514
公开日2011年8月31日 申请日期2008年11月20日
发明者冯小海, 徐虹, 李莎, 欧阳平凯, 陈飞 申请人:南京工业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),