微生物的制作方法

专利名称:微生物的制作方法
本申请为申请号94115663.X、申请日1994年9月5日、发明名称“顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制造方法”、以及其分案申请的申请号01137461.6、发明名称“L-脯氨酸3位羟基化酶的制造方法”、其分案申请的申请2004100946109、发明名称“微生物”的分案申请。
本发明是涉及工业上有利地制造作为医药品合成原料或食品添加剂的有用的顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法上的有用的新的L-脯氨酸3位羟基化酶。
作为以往的顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制造方法，化学合成方法是已经公知的〔Journal of the American Chemical Society(J.Amer.Chem.Soc.)、843980(1962)、同书的85、2824(1963)、Nature、289、310(1981)、Journal of Organic Chemistry(J.Org.Chem.)、54、1866(1989)、Acta Chemica Scandinavica、43、290(1989)〕。
但是，在将L-脯氨酸直接在不同位置及立体选择地羟基化后，制造顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法中，同时利用合成化学方法及生物机能的方法，目前尚没有报导。
以往的用化学合成法制造顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制造方法，由于(1)原料昂贵、(2)反应工序长、(3)分离精制工序复杂、(4)生产效率低等的缺点，所以作为工业上的制造方法未必是满意的方法，因而，目前寻求一种工业上有利的顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制造方法。
本发明的目的在于，提供一个利用发酵法从廉价的糖源在工业上廉价生产出的L-脯氨酸为原料，通过直接用微生物或酶进行羟基化处理后，以工业规模且方便地制造顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法及用于该方法的L-脯氨酸3位羟基化酶。
按照本发明的方法，可以提供顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制造法及新的L-脯氨酸3位羟基化酶，其特征是将可在L-脯氨酸的3位上催化羟基化反应的酶源、二价铁离子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介质中，使得L-脯氨酸转化成顺式-3-羟基-L-脯氨酸，而后从该培养物中或该水溶性介质中提取生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
用于本发明的顺式-3-羟基-L-脯氨酸制造法中的酶源，只要是在羟基化L-脯氨酸时，具有催化生成顺式-3-羟基-L-脯氨酸的活性就可以，例如，微生物的培养物、菌体、菌体处理物、精制酶或粗酶中的任何一种均可。作为微生物的合适例子可举出链霉菌(Streptomyces)属、或者芽胞杆菌(Bacillus)属的微生物。具体的可举出灰色链霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC 12646、链霉菌属菌(Streptomyces sp.)TH1、芽胞杆菌属菌(Bacillus sp.)TH2及TH3，或者这些菌株的继代培养物、突变体或者衍生物等。
链霉菌属菌(Streptomyces sp.)TH1是本发明者们从土壤中重新分离出的微生物。以下表示了链霉菌属菌(Streptomyces sp.)TH1的菌学性质。
关于本发明的微生物的保藏信息。
所述链霉菌属菌(Streptomyces sp.)TH1在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M94040。
所述芽胞杆菌属菌(Bacillus sp.)TH2在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M94041。
1.形态的性质表示在表1中。
表1形态的性质
2.培养的性质
TH1株在一般使用的合成及天然培养基中显示了普通的或旺盛的繁殖，基生菌丝呈浅桃色、橙色或绿褐色。根据不同培养基也可能产生茶色或者黑色的可溶性色素。
在各种培养基上，在28℃下进行14天培养时的特征表示在表2-(1)及表2-(2)中。此外，颜色的表示是按照颜色协调手册(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))的颜色分类而进行的。
表2-(1)培养上的性质
表2-(2)培养上的性质
3.生理学方面的性质TH1株的生理学的性质表示在表3中。繁殖温度范围是7天后的结果，其它是在28℃、2～3周后的结果。
表3生理学的性质
4.化学分类学方面的性质菌体中的二氨基庚二酸的旋光异构体LL型以上，按形态是在气菌丝上形成了螺旋状的由10个以上胞子构成的胞子链。按化学分类，细胞壁是I型(LL-二氨基庚二酸)，所以本菌株被分类为放线菌中的链霉菌属。
将本菌株命名为链霉菌属菌(Streptomyce ssp.)TH1，按照布达佩斯条约，平成5年9月1日寄存在工业技术院生物工程技术研究所，寄存号为FERM BP-4399。
芽胞杆菌属菌(Bacillus sp.)TH2及TH3是本发明者从土壤中分离出的微生物。以下表示两菌株的菌学性质。
细胞的大小，TH2是1.5～1.8×3～4μm、TH3是1.2～1.5×3.5～4μm，DNA的碱基组成(G+C mol％)，TH2是36.46％、TH3是37.74％。此外，2株菌均具有以下的性质。
1.形态的性质TH2及TH3的形态的性质示于表4。
表4形态性质
2.培养方面的性质在各种培养基上，28℃下培养14天后的繁殖及颜色特征表示在表5中。此外，颜色的表示是按照(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))颜色分类进行的。
表5培养方面的性质
3.生理学性质TH2及TH3的生理学性质示于表6-(1)及表6-(2)中。
表6-(1)生理学性质
(W弱)
表6-(2)酸及气体的生成
+生成，-不生成
4.其它各种性质表示在表7中，化学分类学性质表示在表8中。
表7其它的各种性质
+有，-无表8化学分类的性质
将具有以上菌学性质的菌与Bergey’s手册(Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology，Vol.2，1986年)上记载的相对应。
从以上结果可以鉴定2个菌株均属于芽胞杆菌(Bacillus)属的细菌，分别命名为芽胞杆菌属(Bacillus sp.)TH2、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)TH3，并根据布达佩斯条约平成5年9月1日寄存在工业技术院生物工程技术研究所，寄存号分别为FERM BP-4397及FERM BP-4398。
培养这些微生物的培养基，只要是含有可使微生物同化的碳源、氮源、无机盐类等，并能高效地培养具有以下催化活性的微生物的培养基，即具有使L-脯氨酸羟基化后，生成顺式-3-羟基-L-脯氨酸反应的催化活性的话，无论是天然培养基、合成培养基都可以。
作为碳源，只要是可使各种微生物同化的话都可以，例如可使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些组分的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。
作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的各种无机酸和有机酸的铵盐、其它含氮化合物以及胨、肉浸汁、酵母浸汁、玉米淀粉汁(コ-ンスチ-プリカ-)、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣加水分解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机物可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养可在振荡培养或者深部通气搅拌培养等的需氧条件下进行。培养的温度是15-37℃，培养时间通常是16-96小时。
培养中的pH保持在5.0-9.0。pH的调节，可用无机或者有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行调节。
作为菌体处理物可举出菌体的干燥物、冷冻干燥物、表面活性剂和/或有机溶剂处理物、酶处理物、超声波处理物、机械磨碎处理物、溶剂处理物、菌体的蛋白馏分、菌体及菌体处理物的固定化物等。另外也可以使用由该菌体萃取出的具有羟基化酶活性的酶，这些酶的精制标样、固定化物等。
另外，也可以使用从该菌体萃取得到的具有催化从L-脯氨酸向顺式-3-羟基-L-脯氨酸的羟基化反应活性的酶，这些酶的精制标样、固定物等。作为具有该活性的酶源可以举出显示下述(1)-(11)的理化性质的L-脯氨酸3位羟基化酶。
该酶是具有(1)-(11)理化性质的新的L-脯氨酸3位羟基化酶。
(1)作用及基质特异性在2-酮戊二酸及二价铁离子的存在下，与游离的L-脯氨酸作用后可生成顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，进行20分钟反应，具有pH6.5-7.5的最佳pH。
(3)pH的稳定性在4℃，进行23小时处理，在pH 6.5-8.0的范围内保持稳定。
(4)最佳温度在pH 7.0，反应15分钟，具有35-40℃的最佳温度。
(5)温度的稳定性在pH 7.5、50℃下，处理30分钟后，失活。
(6)阻碍剂用Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金属离子及乙二胺四乙酸(EDTA)进行阻碍。
(7)活化活化时，不需要辅酶，向反应液中添加L-抗坏血酸可以促进反应。
(8)Km值在100mM的N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液(pH7.0)中含有5mM L-抗坏血酸、1mM硫酸亚铁及酶标准样品的反应液中测得的，对于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，对于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等电点用Phast系统(Phast system；弗尔玛西亚公司制)测定的等电点是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法测定时，是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列号1表示的N末端氨基酸序列。
(N末端)1 MetCysSerHisIleLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal这些酶源在反应液中的酶活性量是根据使用的基质量等确定的，一般是1.0-10,000,000U/l、优选的是1,000-2,000,000U/l。使用微生物的菌体及菌体处理物时，其浓度，通常以湿菌体计为1-300g/l。
用于反应的L-脯氨酸的浓度是1mM-2M。
反应时，需要二价铁离子，通常使用1-100mM。作为使用的二价铁离子，只要所含的二价铁不阻碍反应，使用任何种类的都可以。例如可举出硫酸亚铁等的硫化物、氯化亚铁等的氯化物，碳酸亚铁等之外，柠檬酸盐、乳酸盐、富马酸盐等之类的有机酸盐。
另外，在反应中需要2-酮戊二酸，可以向反应液中添加酮戊二酸或也可以使用通过所用菌体及菌体处理物具有的代谢活性可转换成2-酮戊二酸的化合物。这样的化合物可举出葡萄糖类的糖质、谷氨酸、琥珀酸等。这些化合物可单独使用，也可数种并用。
作为水溶性介质，可举出水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷等缓冲液(TRIS)、甲醇、乙醇等的醇类、醋酸乙酯等的酯类、丙酮等的酮类、乙酰胺等的酰胺类等。
反应可在具有使L-脯氨酸羟基化后，可以生成顺式-3-羟基-L-脯氨酸反应的催化活性的上述微生物的培养物中进行，也可以使用从该培养物分离出的菌体或者该菌体的处理物或者用精制酶和粗酶，在水介质中进行。
反应通常是在温度15-50℃、pH 6.0-9.0条件下，进行1-96小时。
必要时，在菌体处理或反应时，添加表面活性剂和有机溶剂。
作为表面活性剂可举出聚氧化乙烯·硬脂酰胺(如萘明(ナイシ-ン)S-215、日本油脂社制等)、十六烷基三甲基铵·溴化物、阳离子FB、阳离子F2-40E等的阳离子表面活性剂、油酰胺硫酸钠、NureXT AB、腊披索尔(ラビゾ-ル)80等的阳离子表面活性剂、聚氧化乙烯山梨糖醇酐·单硬脂酸酯(如，非离子ST 221)等两性表面活性剂、其它叔胺PB、六癸基二甲胺等，只要是促进反应任何的都可以使用。使用的浓度通常为0.1-50mg/ml，优选1-20mg/ml的浓度。
作为有机溶剂可以使用甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯、醋酸乙酯等。使用的浓度通常是0.1-50μl/ml，优选1-20μl/ml。
作为从培养物中或水溶性介质中回收顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，可以使用离子交换树脂等的柱色谱或结晶法等的通常分离方法。被回收的顺式-3-羟基-L-脯氨酸可用13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、比旋光度等通常的分析手段确认其结构。
以下，说明本发明的顺式-3-羟基-L-脯氨酸的制取方法。
这种酶的制取方法是首先培养具有生产L-脯氨酸3位羟基化酶能力的微生物，在培养物中生成积蓄了L-脯氨酸3位羟基化酶，从该培养物中提取L-脯氨酸3位羟基化酶而得到。
只要是具有生产L-脯氨酸3位羟基化酶的微生物，无论是野生株、或其继代培养物、突变体、诱变体等任何一种微生物都可以使用。适宜的例子有属于链霉菌(Streptomyces)属或芽胞杆菌(Bacillus)属，而且具有生产L-脯氨酸3位羟基化酶能力的微生物。具体的可举出上述的灰色链霉菌(Streptomyces canus)ATCC12647及ATCC 12646、链霉菌属(Streptomyces sp.)TH1、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)TH2及TH3、或者这些菌株的继代培养物、突变体或诱变体。
培养这样微生物的培养基，只要含有可同化微生物的碳源、氮源、无机盐类等，并且有效地培养具有生成L-脯氨酸3位羟基化酶能力的微生物，无论天然培养基、合成培养基都可以使用。
作为碳源可以使用各种可同化微生物的碳源，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖类的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。
作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的各种无机酸和有机酸铵盐、其它的含氮化合物以及胨、肉汁、酵母汁、玉米淀粉汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣及大豆渣子加水分解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养可在振荡培养或者深部通气搅拌培养等的需氧条件下进行。培养的温度是15-37℃，培养时间通常是16-96小时。
培养中的pH保持在5.0-9.0的调节，可用无机或者有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行调节。
在培养时，根据需要也可添加L-脯氨酸。
在这样得到的菌体中是否生成了L-脯氨酸3位羟基化酶，可通过向培养物中或在含有该菌体或菌体处理物的适合于酶反应的水性介质中加入L-脯氨酸、二价铁离子及2-酮戊二酸，进而需要时，添加表面活性剂和有机溶剂观察是否使L-脯氨酸转化成顺式-3-羟基-L-脯氨酸而加以确定。
用此反应来确认顺式-3-羟基-L-脯氨酸的生成，在菌体中确认其生成的L-脯氨酸3位羟基化酶的活性，可用以下的方法测定。酶的活性，可用在下述测定条件下，把1分钟内生成1nmol的顺式-3-羟基-L-脯氨酸的活性作为1个单位(U)来表示。
在含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亚铁及5mM L-抗坏血酸的100mM的TES缓冲溶液(pH7.0)中，添加酶标品，合计100μl，在35℃下反应10分钟。在100℃下，加热反应液2分钟，停止反应后，用高速液相色谱定量测定在反应液中生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
定量时，只要是可以定量测定顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法，采用任何的方法都可以。例如可举出通常使用的高速液相色谱的后置柱衍生化法或者预先使用NBD氯化物(7-氯-4-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑)使反应液中的目的化合物NBD衍生化，将其放在使用高速液相色谱的逆相色谱上分离NBD衍生物后，使用荧光(激励波长503nm、荧光波长541nm)进行定量的方法(前置柱衍生物化法)等。再者，用前置柱衍生物化法的鉴定可以按照乌利姆·J.林德布拉特及罗伯特·F·狄盖尔曼等人的方法〔(Analytical Biochemistry)、138、390、(1984)〕上的方法进行。
从培养液离析精制酶时，可采用通常的酶的离析、精制法。例如，离心分离营养液并集菌后，通过超声波破碎和法式挤压机、曼特高林机(マントンガウリン)、动力磨等的机械破碎，得到无细胞提取液。将得到的离心沉淀后的上清液，通过进行如用硫铵等的盐析、DEAE(二乙胺乙基)-琼脂糖等阴离子交换色谱层析、丁基纤维素、苯基纤维素等疏水性的色谱层析、使用分子筛的凝胶过滤法、等电点电泳等的电泳法等，可得到精制酶标样。得到酶标样的理化特征，可用通常酶学的方法鉴定。
用这种方法得到的L-脯氨酸3位羟基化酶具有下述(1)-(11)的理化性质。
(1)作用及基质特异性在2-酮戊二酸及二价铁离子的存在下，作用在游离的L-脯氨酸后，可生成顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，反应20分钟时，具有最佳pH6.5-7.5。
(3)pH稳定性在4℃下，进行23小时处理，在pH6.5-8.0的范围保持稳定。
(4)最佳温度在pH7.0、反应15分钟时，具有最佳温度35-40℃。
(5)温度稳定性在pH7.5、50℃下处理30分钟失活。
(6)阻碍剂由于Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金属离子及EDTA可受到阻碍。
(7)活化活化时，无必要使用辅酶。向反应液中添加L-抗坏血酸可促进反应。
(8)Km值在100mM的TES缓冲溶液(pH7.0)中，含有L-抗坏血酸、1mM硫酸亚铁及酶标样的反应液中进行测定的对于L-脯氨酸的Km值是0.49，对于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等电点用Phast(Phast system；フルマミア社制)系统测定的等电点是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法测定时是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列号1表示的N末端氨基酸。
以下说明本发明的实施例。
实施例1顺式-3-羟基-L-脯氨酸的生成将SR3培养基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％、胰胨0.5％、肉浸汁0.3％及磷酸镁0.05％，用6N NaOH调节成pH 7.2的培养基〕，分别以10ml注入到试管(直径25mm×200mm)中，在120℃下，杀菌20分钟。在此培养基上用一铂环移植在HT琼脂平板培养基上〔含可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母浸汁0.1％、肉浸汁0.1％及琼脂1.5％，用6N NaOH调到pH7.2后，在120℃下，杀菌20分钟的培养基〕繁殖的链霉菌(Strep-tomyces sp.)TH1，并在28℃下振荡培养2天，作为种培养液使用。将本种培养液进而分注到2升的三角烧瓶中，移植到在120℃下进行20分钟杀菌了的200ml的SR3培养基上，在28℃下振荡培养2天。将此培养液无菌地接种到在5升的发酵缸中分注了2升的DF3培养基上〔含有可溶性淀粉5％、玉米淀粉汁3.0％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁7水盐0.05％及碳酸钙0.5％，用6N NaOH调节为pH 7.0的培养基〕，并在700rpm、1vvm的条件下于28℃，培养2天。培养中不调节pH值。将得到的培养液用15000×g、4℃下离心分离10分钟，每1升培养液得到75g湿菌体。在4℃下，用生理盐水洗涤湿菌体，离心后至使用时为止要冷冻保持在-80℃下。
将得到的湿菌体1.0g悬浮在10ml的反应液(a)中〔在含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、5mM L-抗坏血酸及1mM硫酸亚铁的100mM TES缓冲液(pH 7.5)中添加1.4％(v/v)奈明(ナイミ-ン)溶液而制成的(其奈明溶液是将4g奈明S-21J(日本油脂株式会社制)溶解在10ml二甲苯中的溶液)〕进行悬浮，而后在30℃下，反应5小时。
反应后，从菌体反应液离心除去菌体，对于上清液中生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸进行分析。
分析是在高速液相色谱上，使用后置柱衍生物化法，在以下的条件下分析。检测是将目的化合物从柱中洗脱出后，在线上NBD衍生物化，使用NBD衍生物的荧光进行的。
高速液相色谱分析条件〔1〕装置岛津制作所制高速液相色谱色谱纸束(chromatopack) CR6A系统控制器 SCL-6B自动注射器 SIL-6B送液泵 LC-6A柱烘箱 CTO-6A化学反应槽 CRB-6A荧光检测器 RF-550A
〔2〕使用柱SUMCHIRAL OA5000(株式会社住化分析中心制)(直径4.5mm×250mm)〔3〕分析条件1)移动相 1mM硫酸铜水溶液2)移动相流速 1.0ml/分3)柱温度 38℃4)缓冲液 0.3M硼酸缓冲液(pH 9.6)25mM EDTA5)缓冲液流速 0.2ml/分6)NBD氯化物溶液0.5g/l甲醇溶液7)上述溶液的流速 0.5ml/分8)反应温度 60℃9)反应时间 约3分10)检测波长 激励波长503nm荧光波长541nm11)试样 10μl其结果，在反应液中生成了910μM(119mg/l)的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
实施例2
顺式-3-羟基-L-脯氨酸的精制将实施例1得到的湿菌体100g悬浮在1升的反应液(a)中，在2升的烧杯中，边搅拌，边在30℃下反应5小时。
反应后，对于从菌体反应液离心除去菌体的上清液中生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸进行分析，其结果，反应液中生成了809μM(106mg/l)的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。将反应上清液调节pH为4.5后使其通过装有200ml迪阿翁离子交换树脂SKIB(NH4+型、三菱化成社制)的塔内。在减压下浓缩出含有顺式-3-羟基-L-脯氨酸馏分后，通过含有迪阿翁离子交换树脂PA412(OH-型、三菱化成社制)20ml的塔。减压浓缩含有顺式-3-羟基-L-脯氨酸馏分后，使pH值调节到9.6后，加入10％体积的邻苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％体积的β-巯基乙醇溶液(10％v/v水溶液)，在60℃下，保持5分钟，使夹杂的直链(一级)氨基酸进行邻位苯二甲醛化。再通过含有10ml的分离珠离子交换树脂SP207(三菱化成社制)，分离邻位苯二甲醛化的夹杂一级氨基酸和顺式-3-羟基-L-脯氨酸。减压浓缩含有顺式-3-羟基-L-脯氨酸馏分后，再次通入含有20ml迪阿翁离子交换树脂PA412(OH-型、三菱化成社制)的塔中，得到含有顺式-3-羟基-L-脯氨酸的馏分。干燥此馏分，得到顺式-3-羟基-L-脯氨酸的白色结晶68mg(收率63％)。
上述化合物的理化性质如下。
比旋光度〔α〕D21＝-93.4°(C＝0.503、H2O)FAB-质谱132(M+H)+13C-NMR谱(D2O、125MHz)ppm33.9、44.5、68.3、71.6、171.31H-NMR谱(D2O、500MHz)ppm2.18(1H)、2.27(1H)、3.52(1H)、3.62(1H)、4.18(1H)、4.77(1H)上述的用比旋光度、质谱测定的分子量、1H-NMR谱、13C-NMR谱等的分析结果，与文献记载的数值是相一致的〔the Jour-nal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem.)、241、1300(1966)〕〔Journal of Antibiotics、45、824(1992)〕及按照文献记载的方法合成的化学合成顺式-3-羟基-L-脯氨酸〔(Liebigs Ann.Chem)、1881、(1979)〕〔四面体(Tetrahedron)、42、2421、(1986)〕。
实施例3顺式-3-羟基-L-脯氨酸的生成使用灰色链霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC12646、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)TH2及TH3进行L-脯氨酸的羟基化。
将SR3培养基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％，胰蛋白胨0.5％，肉浸汁0.3％以及磷酸镁0.05％，并用6N NaOH调节至pH 7.2的培养基〕，各以10ml分注到试管(直径25mm×200mm)中，在120℃下，进行20分钟杀菌。而后用一铂环将生长在HT琼脂培养基上的各菌株移植在此培养基上，在28℃、振荡培养1天，作为种培养液使用。
另一方面，将Df4培养基〔含有甘油2.5％、葡萄糖2.5％、大豆粉1.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁7水合盐0.05％、碳酸钙0.5％，并用6N NaOH调节pH为7.0的培养基〕，各以10ml分注到试管(直径25mm×200mm)中，在120℃下，杀菌20分钟。在此培养基上无菌地接种种培养液1ml，在28℃下，振荡培养1天。得到的培养液2ml用15000×g、4℃下离心分离10分钟。而后用80mM TES缓冲液(pH7.5)洗涤得到的菌体后，离心分离。把得到的湿菌体悬浮在1ml的反应液(a)中，在30℃下，进行3小时反应。
其结果，在反应液中分别生成了242μM、202μM、318μM、141μM的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
实施例4顺式-3-羟基-L-脯氨酸的生成将芽胞杆菌属菌(Bacillus，sp)TH2及TH3使用添加了L-脯氨酸1g/l的Df2培养基〔含有可溶性淀粉5％、干燥酵母1.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁7水合盐0.05％、碳酸钙0.5％，用6NNaOH调节为pH7.0的培养基〕代替Df4培养基，与实施例3同样地进行1天种培养，在Df2培养基上进行1天培养。其结果，在培养液的上清液中生成TH2株745μM(97.6mg/l)、TH3株327μM(42.8mg/l)的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
实施例5L-脯氨酸3位羟基化酶的离析精制(1)无细胞提取液的配制将由实施例2得到的冷冻菌体30g溶解后，在冰冷下悬浮在200ml的缓冲液(A)中〔含有1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.2mMEDTA、0.1％(V/V)吐温(Tween 20)及10％(V/V)甘油的20mM哌嗪缓冲液(用6N HCl调节pH为5.3)〕，在冰冷下，用超声波破碎悬浮液中的菌体，在4℃下，用30000×g进行30分钟离心后得到上清液。
以后的操作均在冰冷乃至4℃下进行。
(2)用柱色谱进行离析及精制(2)-1.酸处理将由上述工序得到的上清液的pH用6N盐酸调节到4.5后，用15,000×g，进行30分钟离心、分离除去生成的沉淀，得到上清液。
(2)-2.RESOURCE Q柱色谱(I)将由上述工序得到的上清液，通过装有用缓冲液(A)进行平衡的弗尔玛西亚社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，6ml)的柱。用缓冲液(A)洗涤后，用在缓冲液(A)中制定的从0-0.3M间的食盐直线浓度梯度溶液，洗脱出含该酶的馏分。
(2)-3.RESOURCE Q柱色谱(II)将由上述工序得到的活性馏分用缓冲液(B)〔含有1mMDTT、0.2mM EDTA及10％(V/V)甘油的20mM TES缓冲液(pH调节为7.5)〕稀释3倍后，通过装有用缓冲液(B)平衡的弗尔玛西亚社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用缓冲液(B)洗涤后，使用在缓冲液(B)中制定的从0-0.3M间的食盐线性浓度梯度溶液，洗脱出含该酶的馏分。
(2)-4.苯基琼脂糖色谱在上述工序得到的活性馏分中，添加、溶解食盐，使食盐浓度达到2M，并使其通过装有用含2M食盐的缓冲液(B)平衡的苯基琼脂糖柱(Phenyl Sepharose HP Hiload，1ml)的塔。用含2M食盐缓冲液(B)洗涤后，使用含0.1％(V/V)吐温20(Tween 20)缓冲液(B)洗脱出含该酶的馏分。
(2)-5.RESOURCE Q柱色谱(III)对于上述工序得到的活性馏分，使用以缓冲液(A)平衡的弗尔玛西亚社制PD-10柱脱盐后，通过装有用缓冲液(A)平衡的弗尔玛西亚社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用缓冲液(A)洗涤后，使用在缓冲液(A)中制得的从0-0.3M间的食盐的直线浓度梯度溶液，洗脱出含该酶的馏分。
(2)-6.RESOURCE Q柱色谱(IV)
将由上述工序得到的活性馏分，用含0.1％(V/V)吐温20(Tween 20)的缓冲液(B)稀释3倍后，通过装有用缓冲液(B)平衡的弗尔玛西亚社制的柱(RESOURCETMQ，1ml)的柱。用缓冲液(B)洗涤后，使用在缓冲液(B)中制得的从0-0.3M间的食盐直线浓度梯度溶液，洗脱出含该酶的馏分。
L-脯氨酸3位羟基化酶的离析及精制的概要总结在表9中表9L-脯氨酸3位羟基化酶的离析及精制的概要
实施例6L-脯氨酸3位羟基化酶的性质(1)电泳分析用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳法(使用ATTO社制聚丙烯酰胺PAGEL NPU-12.5L及BIORAD社制分子量标准SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range)分析实施例5得到的精制酶标样。其结果，明显地看出该酶是由分子量35000±5000大致均一的亚单位构成的。
(2)关于酶反应的性质使用以下的反应液，通过进行反应成分基质省略试验(Omis-sion test)及添加物试验研究L-脯氨酸3位羟基化酶反应的必需化合物、促进化合物、阻碍化合物。
基本反应液组成是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亚铁、5mM L-抗坏血酸及酶标样的100mM的TES缓冲液(pH 7.0)，总计液量为100μl。通过添加酶开始反应，在35℃下反应10分钟。反应液在100℃下加热2分钟，停止反应后，按照前置柱衍生物化法，使用高速液相色谱定量在反应液中生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。向100μl反应液中添加0.3M硼酸缓冲液(pH 10.7)100μl、10％(V/V)巯基乙醇水溶液4μl及5％(W/V)邻苯二甲醛的乙醇溶液16μl，在60℃下放置30秒。进而加入2％(W/V)NBD氯化物的乙醇溶液50μl，在60℃下反应40分钟。加入1N盐酸30μl停止反应后，通过离心、过滤除去沉淀后，用高速液相色谱进行分析，定量生成的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
在以下条件进行高速液相色谱分析移动相10mM柠檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(V/V)流速1ml/分柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制、6×150mm)柱温度50℃检测荧光检测、激励波长503nm、荧光波长541nm从其结果可看出，在L-脯氨酸3位羟基化时，L-脯氨酸、2-酮戊二酸、Fe++离子是必需的，L-抗坏血酸有促进反应的作用，另外，Zn++、Cu++、Co++及Ba++离子及EDTA的添加可阻碍反应。
其结果表示在表10中。
表10酶反应成分的研究
1)标准反应液成分是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亚铁、5mM L-抗坏血酸及酶标样的100mM TES缓冲液，pH是7.0，液量总计100μl。反应是在35℃下进行10分钟。
2)添加物(+)，在标准反应液中添加以表中+表示的化合物进行反应。无添加(-)，从标准反应液中除去以表中-表示的化合物进行反应，表中表示的浓度是反应液的浓度。
3)活性，以标准反应液的活性作为100表示其相对值。
(3)最佳pH在L-脯氨酸3位羟基化酶活性测定法中，用下述缓冲液置换反应液中的缓冲液成分，进行反应，即pH 5.5-6.0时，用MES〔2-(N-吗啉)乙磺酸〕缓冲液、pH6.5-7.5时，用PIPES〔哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)〕缓冲液、pH7.0-8.0时，用TES缓冲液、pH8.0-9.0时，用TAPS〔N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)〕缓冲液进行反应的结果，pH为6.5-7.5时显示了最高活性的80％以上。其结果表示在表11中。
表11反应的最佳pH
1)活性是对最高活性作为100时的相对活性(4)pH稳定性缓冲液(B)中的本发明的酶液用100mM缓冲液〔pH 5.5-6.5时，用MES缓冲液、pH 6.1-7.5时，用PIPES缓冲液、pH 7.0-8.0时，用TES缓冲液、pH 8.0-9.0时，用TAPS缓冲液〕稀释3倍，在4℃，保持23小时后，测定活性。pH范围保持在6.5-8.0范围的酶具有保持前面的活性的80％以上的活性，说明pH在6.5-8.0的范围内活性保持稳定。
(5)最佳温度在测定L-脯氨酸3位羟基化酶的活性时，在15-50℃的温度范围内，进行15分钟反应，其结果显示出在35-40℃时，有最高活性的80％以上的活性。结果表示在表12中。
表12反应的最佳温度
1)活性是以最高活性为100时的相对活性表示的(6)温度的稳定性将本发明的酶在缓冲液(B)中，在0-60℃的温度范围内保持30分钟后，测定其活性。结果表明，本发明酶在50℃下，处理30分钟完全失活。
(7)Km值在含有100mM TES缓冲液(pH 7.0)、1mM硫酸亚铁、5mML-抗坏血酸及酶标样反应液中测定，对于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，对于2-酮戊二酸Km值是0.11mM。
(8)等电点用Phast系统(Phast system；弗尔玛西亚社制)测定等电点的结果，等电点是4.3。
(9)N末端氨基酸序列使用Protein sequencer model PPSQ-10(岛津制作所社制)分析本发明酶蛋白的N末端氨基酸序列，得到以下结果(N末端)1 MetCysSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal(序列号1)实施例7L-脯氨酸的羟基化使用实施例5得到的精制酶标样进行L-脯氨酸的羟基化。
使用含有20mM 2-酮戊二酸、20mM L-脯氨酸、5mM L-抗坏血酸、1mM硫酸亚铁及106U的精制酶标样的200mM TES缓冲液(pH 7.0)100μl，在35℃反应30分钟。其结果，在反应液中生成18mM(2.4g/l)的顺式-3-羟基-L-脯氨酸。
序列表序列号 1序列长度 29序列类型 氨基酸拓谱学 直链状序列的种类 肽起源 链霉菌属(Streptomyces sp)株名 TH1(FERM BP-4399)序列Met Cys Ser His IIe Leu Gly Arg IIe Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly1 5 10 15Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val20 25根据本发明，可以提供对于用发酵法从糖源工业性地生产的L-脯氨酸，通过微生物或酶的直接羟基化，在工业上有效地制造顺式-3-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法的有用的新的L-脯氨酸羟基化酶。
权利要求
1.保藏编号为CCTCC M94041的芽胞杆菌属菌(Bacillus sp.)TH2菌株。
专利摘要
本发明提供一种微生物，该微生物具有催化从L－脯氨酸生成顺式－3－羟基－L－脯氨酸的反应的活性，并属于芽胞杆菌属(Bacillus)。
文档编号C12R1/07GK1990855SQ200610164019
公开日2007年7月4日 申请日期1994年9月5日
发明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎刚, 安藤胜彦, 落合惠子, 千叶繁, 宇於崎洋一 申请人:协和发酵工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan