专利名称:一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法
技术领域：
一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，属于小麦加工副产物的综合利用技术领域：
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背景技术：
小麦麸皮是小麦加工的副产物，每年小麦麸皮的产量在2000多万吨以上，资源丰富，值得开发和利用。目前，我国小麦麸皮主要用作畜禽饲料、发酵培养基等，价格低廉，对于许多大型的面粉加工企业来说，如果能实现小麦麸皮的有效增值和利用，将具有十分重要的经济效益和社会效益。
抗冻蛋白是一种具有非依数性降低冰点作用的蛋白质，在动物、植物、昆虫等有机体抵抗外界寒冷环境的过程中具有重要的作用。它在极低的浓度下就可以使有机体提高抵抗寒冷的能力，可以避免在冷冻-解冻后肌体的损伤。因此，抗冻蛋白在农业、食品、医学等领域都具有非常重要的作用。
北方冬小麦在生长过程中，经受冷应激，在其麸皮中会产生抗冻蛋白以抵抗外界的寒冷。因此，以北方冬小麦麸皮为原料，制备抗冻蛋白，可以广泛应用于农业、食品、医学等领域，市场前景广阔。在农业生产中，可以将抗冻蛋白基因转入目标作物，以提高目标作物的耐寒能力，扩展作物的生存环境；在食品工业中，抗冻蛋白具有改善食品质构，延长食品保质期等功能；在医学领域中，抗冻蛋白可以使低温保护精子细胞、卵母细胞和其它体细胞等的存活率提高，可以在冷冻手术中保护肌体细胞等作用。随着抗冻蛋白应用范围的不断扩展，抗冻蛋白的市场将进一步扩大。
发明内容本发明的目的是提供一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，最大限度地将小麦麸皮中的抗冻蛋白提取出来，并对其进行分离纯化，以开发天然有效的低温保护剂，从而实现麸皮的增值和深加工。
本发明的技术方案以小麦麸皮为原料，用小麦麸皮质量/体积比10倍量的去离子水提取，所得提取液使用80％的硫酸氨沉淀，将沉淀在抗冻蛋白提取液中复溶，浓缩，冻干，得小麦麸皮抗冻蛋白粗品；将小麦麸皮抗冻蛋白粗品再次在抗冻蛋白提取液中复溶，依次经过离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到小麦麸皮抗冻蛋白，其纯度达到84.47％；(1)去离子水提取将小麦麸皮与10倍质量/体积比的去离子水混合，20℃，200转/分钟搅拌4小时，将混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集上清液；(2)用硫酸氨沉淀向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末，达到80％硫酸氨的饱和浓度，静置60分钟。将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集沉淀；(3)复溶、透析、冻干得到粗品将沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中，将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析；透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，该冻干粉为小麦麸皮抗冻蛋白粗品；(4)粗品复溶将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中，浓度为20mg/ml；(5)离子交换色谱纯化用DEAE Sepharose Fast Flow柱，Φ30×300mm，对小麦麸皮抗冻蛋白粗品进行分离，分离首先使用1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时，接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱，流速为1.2ml/min，紫外检测器检测波长为280nm，收集图1中的P3馏分，将P3馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，得到P3馏分冻干粉；(6)凝胶过滤色谱纯化将P3馏分的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中，使用Sephadex G75，Φ20×800mm，进一步进行分离，洗脱液为抗冻蛋白提取液，流速为0.8ml/min，收集图2中的P2馏分，将P2馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，标记为P32，即为小麦麸皮抗冻蛋白冻干粉产品。
所用抗冻蛋白提取液的组成为含1mM蛋白酶抑制剂的20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0。
本发明所制备的麸皮抗冻蛋白为纯天然产品，在加工过程中未添加任何有毒，有害的物质，因此可以广泛的应用于农业、食品、医学、生物技术等行业。
本发明的有益效果通过硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、冷冻干燥等方法，将麸皮中的抗冻蛋白进行分离，显著的提高了麸皮的价值，为谷物的深加工提出一条新的途径。
图1小麦麸皮抗冻蛋白粗品使用离子交换柱的分离效果。
图2P3冻干粉使用凝胶过滤色谱柱的分离效果。
图3HPLC检测小麦麸皮抗冻蛋白的纯度具体实施方式
实施例1准确称量小麦麸皮500g，与5000ml去离子水混匀，20℃，200转/分钟搅拌4小时，将混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集上清液。向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末，达到80％硫酸氨的饱和浓度，静置60分钟。将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集沉淀，并将上述沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中(20mM磷酸盐缓冲液，1mM蛋白酶抑制剂，pH8.0)，将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6,000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，该冻干粉称为小麦麸皮抗冻蛋白粗品，20克左右。
将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中，浓度为20mg/ml。使用DEAE Sepharose Fast Flow柱(Φ30×300mm)对上述粗品进行分离，分离首先使用1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时，接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱5小时，流速为1.2ml/min，紫外检测器检测波长为280nm，洗脱分离效果如图1。收集图1中的P3，并将P3放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，得到P3冻干粉0.5克左右。
将上述P3的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中，使用Sephadex G75(Φ20×800mm)进一步进行分离，洗脱液为抗冻蛋白提取液，流速为0.8ml/min，洗脱7小时，分离效果如图2。收集P2，并将P2放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析。透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩。当浓缩到原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，标记为P32，0.3克左右。
将P32复溶于抗冻蛋白提取液，浓度为2mg/ml。使用Shodex KW804 ProteinColume对P32的纯度进行鉴定。结果见图3。色谱条件为50mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度为1.0ml/min，紫外检测器波长为220nm。保留时间为11.694分钟的组分为小麦麸皮抗冻蛋白，根据峰面积计算可以发现，小麦麸皮抗冻蛋白的含量为84.47％。
权利要求
1.一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，其特征是以小麦麸皮为原料，用小麦麸皮质量/体积比10倍量的去离子水提取，所得提取液使用80％浓度的硫酸氨沉淀，将沉淀在抗冻蛋白提取液中复溶，浓缩，冻干，得小麦麸皮抗冻蛋白粗品；将小麦麸皮抗冻蛋白粗品再次在抗冻蛋白提取液中复溶，依次经过离子交换柱和凝胶过滤柱进行分离纯化，最终得到小麦麸皮抗冻蛋白，其纯度达到84.47％；工艺为(1)去离子水提取将小麦麸皮与10倍质量/体积比的去离子水混合，20℃，200转/分钟搅拌4小时，将混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集上清液；(2)用硫酸氨沉淀向上清液中缓慢加入硫酸氨粉末，达到80％硫酸氨的饱和浓度，静置60分钟，将静置后的混合液在2000g的离心力下离心30分钟，收集沉淀；(3)复溶、透析、冻干得到粗品将沉淀复溶于抗冻蛋白提取液中，将复溶的蛋白液放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液充分透析；透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，该冻干粉为小麦麸皮抗冻蛋白粗品；(4)粗品复溶将小麦麸皮抗冻蛋白粗品复溶于抗冻蛋白提取液中，浓度为20mg/ml；(5)离子交换色谱纯化用DEAE Sepharose Fast Flow柱，Φ30×300mm，对小麦麸皮抗冻蛋白粗品进行分离，分离首先使用流速1.2ml/min的抗冻蛋白提取液洗脱1小时，接着使用0-1.5M NaCl梯度洗脱5小时，流速为1.2ml/min，紫外检测器检测波长为280nm，收集图1中的P3馏分，将P3馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，得到P3馏分冻干粉；(6)凝胶过滤色谱纯化将P3馏分的冻干粉复溶于抗冻蛋白提取液中，使用Sephadex G75，Φ20×800mm，进一步进行分离，洗脱液为抗冻蛋白提取液，流速为0.8ml/min，收集图2中的P2馏分，将P2馏分放置于截留分子量为6000Da的透析袋中对抗冻蛋白提取液透析，透析后，使用聚乙二醇10000对透析袋进行浓缩，当浓缩到本次复溶液原体积的1/15时，停止浓缩，进行冷冻干燥，标记为P32，即为小麦麸皮抗冻蛋白冻干粉产品。
2.根据权利要求
1所述的制备方法，其特征是所用抗冻蛋白提取液的组成为含1mM蛋白酶抑制剂的20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0。
3.一种用权利要求
1所述方法制备得到的小麦麸皮抗冻蛋白的应用，其特征是用于农业、食品、医学、生物技术行业。
专利摘要
一种小麦麸皮抗冻蛋白的制备方法，属于小麦加工副产物的综合利用技术领域：
。本发明以小麦麸皮为原料，经水提取、硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和冷冻干燥等步骤，分离得到小麦麸皮抗冻蛋白。本发明首次介绍了从小麦麸皮中分离纯化抗冻蛋白的方法。所得小麦麸皮抗冻蛋白产品可用于农业、食品、医学等行业，从而实现小麦麸皮的有效增值和利用。
文档编号A23J1/00GK1995062SQ200610166427
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月15日
发明者张晖, 张超, 姚惠源, 郭晓娜, 王立 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan