专利名称:蛋白质的生产的制作方法
本发明涉及到生产蛋白质的方法。
各种生理活性蛋白质，象细胞素和肽类激素的存在已被证明，遗传工程技术上的最新进展已使得能够大规模生产这些生理活性蛋白质及将其用于临床。
白细胞介素-2〔下文中简写成IL-2;也叫T细胞生长因子(TCGF)〕是一种通过尤其是外源凝集素或异抗原刺激T细胞而产生的淋巴因子〔Science，193，1007(1976)〕。
利用IL-2，到目前为止已经获得了大量的杀伤T细胞或辅助T细胞以及天然杀伤细胞的无性系(例如Nature，268，154(1977)〕。除直接用于无性繁殖T细胞或天然杀伤细胞外，应用IL-2可导致在体外选择性增殖能识别并摧毁某种特定抗原，例如一种肿瘤抗原的专一抗原杀伤T细胞。将这样生长的肿瘤专一性杀伤T细胞引入动物体内能够控制或抑制肿瘤的生长〔The Journal of Immunology，125，1904(1980)〕。
这些试验的发现表明了IL-2作为一种抗肿瘤剂应用的可能性。进而得知IL-2重建了缺乏thumus功能的裸鼠辅助T细胞功能〔European Journal of Immunology，10，719，(1980)〕并恢复了杀伤T细胞对异源细胞的感应〔Nature，284，278(1980)〕，因此，IL-2有希望用于治疗免疫缺乏症。
干扰素-α〔下文简称IFN-α〕和干扰素-γ(下文简写为IFN-γ)是病毒或核酸激活的淋巴细胞产生的淋巴因子，它们具有作用于细胞并使之进入抗病毒状态的生物学活性，并因此在防御系统或肿瘤免疫系统中起重要作用。
象细胞素这样一类的蛋白质可象天然产生的一样获得，但数量非常有限。然而，重组DNA技术的最新成果已经开创了从大菌杆菌等的培养菌株中回收生物活性蛋白质的方法，这些菌株中分别携有上述蛋白质基因的表达载体〔对IL-2Nature，302，305(1983)和Nucleic Acids Research，11，4307(1983);对IFN-α，Journal of Interferon Research 1，381(1981);对IFN-γNature，295，503(1982)〕。
因为无论是在真核生物或原核生物中，蛋白质的生物合成起始于表达蛋氨酸的信使RNA密码子AUG，所以产物蛋白质可能是一种在N末端有蛋氨酸残基的分子或没有该残基的分子甚或两种分子的混合物。事实上已知在大肠杆菌中，许多细胞蛋白质的末端是蛋氨酸〔Conn & StumpfOutlines of Biochemistry，4th edition，John Wiley & Sous(1976)〕而且大肠杆菌的起始因子IF-3就含有N末端有蛋氨酸残基的分子和没有该残基的分子〔Hoppe-Seyler′s Zeitschrift für Physiologische Chemie，354，1415(1973)〕。说到用重组DNA技术在大肠杆菌中产生的蛋白质，已知对于IFN-α加入于N末端的蛋氨酸残基百分比大约是50%〔Journal of Interferon Research，1，381(1981)〕，而对于人生长激素则高达100%〔Nature，293，408(1981)〕。然而到目前为止，还没有在这些蛋白质中蛋氨酸残基加入百分比控制实例的报道。在他们的用植入了IL-2基因的大肠杆菌菌株生产IL-2蛋白质的方法的研究过程中;本发明者发现大肠杆菌产生的IL-2蛋白是由两种分子构成的，即N末端没有蛋氨酸残基的IL-2，这是一种以丙氨酸残基作为N末端氨基酸〔Ala-IL-2〕起始的分子，以及在N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酸丙氨酸残基〔Met-Ala-IL-2〕起始的分子，后者的含量比前者高得多。
类似的有，已发现大肠杆菌产生的IFN-α和IFN-γ的每一种都是N末端以半胱氨酸起始的分子〔分别为Cys-IFN-α和Cys-IFN-γ〕与N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酰半胱氨酸残基〔分别为Met-Cys-IFN-α和Met-Cys-IFN-γ〕起始的分子的混合物，后者占5-50%。
这些N末端具有蛋氨酸残基的蛋白质应该具有与天然类型的相应蛋白质相似的生物学活性，但无论如何是与后者不同的物质。因此，已知的方法在生产具有天然类型各自氨基酸序列的蛋白质方面不能完全令人满意。
本发明提供了通过培养具有表达载体的大肠杆菌生产蛋白质的改善方法，表达载体在转译起始密码子的下游含有该蛋白质的结构基因，该方法包括在含有(1)铁离子，锰离子或其混合物以及(2)天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌增加N末端没有对应于转译起始密码子ATG的蛋氨酸的蛋白质产率。
对于上述蛋白质，可提及的有各种各样的生物活性蛋白质，例如象干扰素(例如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)，白细胞介素(例如白细胞介素-I，IL-2)，B细胞生长因子(BGF)，B细胞分化因子(BDF)，巨噬细胞激活因子(MAF)，淋巴毒素(LT)以及肿瘤坏死因子(TNF)一类的细胞素;转化生长因子(TGF-α);肽蛋白质类激素，例如促红细胞生成素，表皮生长因子，胰岛素和人生长激素;病源微生物抗原蛋白，例如乙型肝炎病毒抗原，流感病毒抗原，口蹄疫病毒抗原和疟原虫抗原;酶类，例如肽酶〔组织血纤维蛋白溶酶原激活因子，尿激酶，肽裂解酶(Serratiopeptidase)〕和溶菌酶;以及血清蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。
本发明方法可有效地应用于下述实例，在这些实例中，包括将IL-2，IFN-α和IFN-γ用通过培养某些大肠杆菌菌株而生产。
这里所说的IL-2指的是任何具有象天然人IL-2一样的生物学或免疫学活性的，诸如IL-2受体结合或抗-IL-2抗体结合功能的物质。例如，这种物质可能是一种具有图1所示氨基酸序列的多肽〔多肽(Ⅰ)〕或含有多肽(Ⅰ)的生物学或免疫学活性所必需的某个氨基酸序列部分的片段，例如多肽(Ⅰ)在其N末端少一个氨基酸〔EPC(laid open)No 91539〕或4个氨基酸(Japanese Patent Application No58-235638，filed on December 13，1983 and laid open under Japanes Patent Publication No 126088/1985)的片段或多肽(Ⅰ)在C末端位置少几个氨基酸的片段。而且，这种物质可能是一种多肽，它在其他方面与上述多肽(Ⅰ)是相同的，但是缺少多肽(Ⅰ)的组成氨基酸的一部分或含有一个或几个多肽(Ⅰ)起始发生的氨基酸以外的氨基酸，例如一种含有一个取代125号半胱氨酸残基的丝氨酸残基的多肽(Ⅰ)类似物〔Japanese Patent Publication(laid open)No 93093/1984〕。上述多肽最好是非糖基化形式。
这里所说的“IFN-α”指的是任何具有象天然人IFN-α一样的生物学或免疫学活性的，诸如IFN-α受体结合或抗-IFN-α抗体结合能力的物质。例如具有图3所示氨基酸序列的多肽〔多肽(Ⅱ)〕。此外，上述物质可能是具有IFN-α的生物学或免疫学活性所必需的部分氨基酸序列的片段，例如多肽(Ⅱ)的一个片段，该片段在N末端或C末端位置缺少几个氨基酸。它也可能是在其他方面与上述多肽(Ⅱ)相同但缺少部分多肽(Ⅱ)的组成氨基酸或含有多肽(Ⅱ)原有氨基酸以外的一个或几个氨基酸。它们中最好的是IFN-αA。
这里所说的IFN-γ指的是任何具有与天然人IFN-γ一样的生物学或免疫学活性的物质，例如具有IFN-γ受体结合或抗-IFN-γ抗体结合的能力。例如图4所示的具有146氨基酸的多肽(Ⅲ)及其各种片段。该片段的特例是一种N末端缺乏的分子，该分子在多肽(Ⅲ)N末端位置缺少多至4个氨基酸，以及一种由多肽(Ⅲ)断裂而产生的C末端缺少分子或者一种对应的在不先于第131个氨基酸残基位点上N末端缺失的分子。此外，上文提到的IFN-γ可为在上述多肽中含有取代半胱氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基的类似物。多肽(Ⅲ)尤其可取。
蛋白质编码结构基因可为任意DNA，天然产生的或合成的均可，它们为上述蛋白质的氨基酸序列编码。
因此，举例来说，对于IL-2，已知的是具有图2所示的碱基序列的DNA〔DNA(Ⅳ)为图1所示的氨基酸序列编码〕;对于IFN-α，已知的有为图3所示的氨基酸序列(IFN-αA)编码的DNA〔DNA(V);例如Japanese Patent Publication(laid open)No.79897/1982〕;而对于IFN-γ，已知的有为图4所示的氨基酸序列编码的DNA〔DNA(Ⅵ);例如Japanese Patent Publication(laid open)No.189197〕。
上述结构基因(DNA)存在于转译起始密码子ATG的下游。上述基因可能位于紧挨着ATG的下游或者经过一段不能表达的间隔物或者在ATG与上述基因之间的某些其他结构基因上。ATG与结构基因最好互相直接连接。
上述结构基因最好在其上游有一启动子。该启动子可为任意参与λ噬菌体生长的λPL或λPR启动子，色氨酸(trp)启动子，乳酸(lac)启动子，肽链延长因子Tu(tuf B)启动子以及recA启动子等等。λPL和trp启动子尤其可能有效地用于本发明的实践。
上述基因和启动子常植入到载体中，从而形成表达载体。作为产生上述载体的质粒最常用的有ColEl产生的PBR322〔Gene，2，95(1977)〕，但任何其他可因为在大肠杆菌中复制而得以保存的质粒也可应用。例如，PBR313〔Gene，2，75(1977)〕，PBR324和PBR325〔Gene，4，121(1978)〕，PBR327和PBR328〔Gene，9，287(1980)〕，PKY2289〔Gene，3，1(1978)〕，PKY2700〔Seikagaku(Biochemistry)，52，770(1980)〕，PACYC177和PACYC184〔Journal of Bacteriology，134，1141(1978)〕以及PRK248，PRK646和PDF41〔Methods in Enzymology，68，268(1979)〕。
噬菌体导出的载体，例如象λgt·λC〔Proceedings of the National Academy of Sciences USA，71，4579(1974)〕，λgt·λB〔ibid.，72，3416(1975)〕和λDam〔Gene，1，255(1977)〕一类的由λ噬菌体导出的λgt系列载体，黄热病毒载体〔Sciences，196，161(1977);Journal of Virology，29，555(1979)〕，和丝状噬菌体导出的载体也可用作表达载体。
上述表达载体可通过适当的已知方法产生〔例如，Nature，302，305(1983);Nucleic Acids Re-search，11，4307(1983);Japanese Patent Publication(laid open)No79897/1982;Japanese Patent Publication(laid open)No.18197/1983〕。
作为已经植入了具有一种蛋白质结构基因的表达质粒所要诱导的宿主，所用的是大肠杆菌的菌株，从操作和安全的角度看，大肠杆菌K-12-衍生菌株是尤其可取的。可被有效地应用的上述大肠杆菌K-12-衍生菌株，举例是294，RR-1，DH-1，N4830和C-4菌株。
294菌株是已知菌株〔Proceedings of National Academy of Sciences USA，73，4174(1976)〕，以贮存号IFO-14171贮存于Institute for Fermentatien，Osaka(IFO)。
RR-1菌株在Gene，2，75(1977)，DH-1菌株在Nature，217，1110(1968)，N4830菌株在Cell，25，713(1981)中进行了描述。由于在宿主中有对温度敏感的cI阻遏物，当λPL用作表达启动子时，N4830菌株特别地有用，并且可从Pharmacia P-L Biochemicals得到。
C-4菌株分别以IFo-14421贮存于IFO，以FERMBP-966于FRI，以0085于CGMCC。
本发明所用的大肠杆菌菌株可通过具有一蛋白质结构基因的表达载体转化宿主大肠杆菌菌株而产生，转化作用可按已描述的方法实现，举例来说，在Journal of Molecular Biology，53，159(1970);Methods in Enzymology，68，253(1979);Gene，3，279(1978)，以及Proceedings of the National Academy of Sciences USA，69，2110(1972)中所描述的方法。
至于本发明，上述大肠杆菌菌株培养于一种含有铁离子和(或)锰离子来源的培养基中。
说到加入于培养基的铁离子和锰离子的来源，铁离子来源指的是溶解时能够产生铁离子的物质或能以铁离子的形式被利用的物质。例如铁盐。最好是二价或三价铁的无机盐(例如，氯化亚铁，氯化铁，硫酸亚铁，硫酸铁，磷酸铁，硝酸铁)，其中最好的是三价铁的无机酸盐(例如，氯化铁，硫酸铁)。
锰离子来源指的是在溶解状态下能够产生锰离子的物质或能以锰离子的形式被利用的物质。这种物质举例有锰盐，特别是锰的无机盐(例如，硫酸锰，氯化锰，碳酸锰，磷酸锰)，最好是锰的无机酸盐(例如，硫酸锰，氯化锰)。
铁离子和锰离子的来源可单独或联合使用。它们最好以水溶液的形式加入。
铁离子和锰离子分别以每升10-6到10-3摩尔，最好是2×10-5到5×10-4摩尔加入。联合应用时，它们分别加入到上述范围以内的浓度。
含有天然氮源的用于培养上述大肠杆菌菌株的培养基是一种通过往已知基本培养基中补充从天然存在物质中获得的氮源而制得的培养基，天然氮源物有诸如酪蛋白氨基酸，蛋白胨，酵母膏或麦芽汁等。补充的氮源浓度常在1g/l到50g/l之间。适于本发明应用的这种培养基的几个实例在表1中给出。
表1
适用培养基实例
成份 改良M-9培养基 M-33培养基 M-03培养基
葡萄糖 10g/l 10g/l 10g/l
Na2HPO46g/l 3g/l -
KH2PO43g/l 3g/l 3g/l
NaCl 0.5g/l 0.5g/l 0.5g/l
NH4Cl 1g/l 1g/l 1g/l
MgSo4·7H2O 0.34g/l 0.34g/l 0.34g/l
酪蛋白
10g/l 10g/l 10g/l
氨基酸
本发明方法可在酸性条件下进行，特别是在大肠杆菌含有一个表达质粒并具有色氨酸启动子(trp)的情况下，这样的大肠杆菌接种于一个PH4.8-6.0的培养基中进行培养，同时保持在该范围内。PH范围在5.0-5.8之间的更为可取;大约PH5.5是最适培养值。
然而，充分生长后，培养条件可能变出这个PH范围，例如更酸一些。
在培养基制备和消毒之前或之后用无机碱或无机酸调节PH。在大肠杆菌培养过程中可能需要调节PH以保持PH在特定范围以内。因为在培养期间PH通常降低，所以加入无机碱，例如氨，氢氧化钠，和碳酸钠调节PH;但如果需要的话，硫酸一类的无机酸也可加入。这些物质中氨水尤其可取，因为它为培养基提供了氮源。
例如，当使用的是含有表达质粒并具有色氨酸启动子的转化菌株，可能要加入一种高效的启动子作用引发剂，例如3-β-吲哚丙烯酸。
如果宿主是一个营养缺陷型，所要求的氨基酸(例如，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-蛋氨酸，L-亮氨酸，L-脯氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-色氨酸)每一种加至浓度约为10-1000mg/l为优选。如果必要，培养过程中也能追加补充葡萄糖，酪蛋白氨基酸及其它组份。而且，为了重组大肠杆菌菌株的选择性生长，根据质粒中存在的抗药性基因或类似物可加入一种该菌株对其有抵抗力的制剂，例如四环素。
上述铁离子或锰离子来源通常预先加入用于大规模培养的培养基中达到一适宜的浓度。离子来源也可加入于种子培养基中。
培养过程一般在15-45℃下进行。例如，在携有λPR或λPL启动子和温度敏感阻遏物的菌株中，25-35℃下增殖继之以升至大约42℃对基因表达是有利的。在携有其它启动子的菌株中，从开始生长到约一半时保持温度在约37℃，然后随着增殖降温，最后维持在20-30℃可获得高生产率。
培养过程通常在通气和搅拌下进行。培养基中氧气的浓度保持在不低于饱和氧气浓度的5%(V/V)水平上的培养过程是有利的，因为在这种情况下，可获得高产率的所需蛋白质。
这样产生的蛋白质可用已知方法检测。
例如，对于检测IL-2来说，可使用-IL-2-依赖细胞系。因为已知人IL-2促进大鼠和小鼠及一些其他IL-2-依赖的细胞系和人细胞系〔Immunological Reviews，51，257(1980)〕的生长，所以不但人IL-2-依赖的细胞系而且大鼠和小鼠的IL-2-依赖的细胞系均可应用〔Journal of Immunology，130，981and988(1983)〕。
特别是IL-2-依赖的小白鼠细胞系可经过长时间的传代而稳定地保存并给出具有高复现性的检测结果。
本说明书中所给出的全部IL-2收率数据是用IL-2-依赖细胞的方法测得的数据，并以放射性胸苷的吸收作为标志〔Biochemical and Biophysical Research Communications，109，363(1982)〕。
Ala-IL-2的产率由下列步骤决定用7M盐酸胍从细胞中提取IL-2，透析提取物，透析液进行下文中将提及的FPLC(快速蛋白液相层析)以分离Ala-IL-2部分和Met-Ala-IL-2部分，用上述方法测定两种部分的IL-2活性，计算IL-2的比率并用此比率乘以IL-2的总产率。
纯化样品根据用FPLC分离的蛋白质在280nm所测得的吸收值之间的比例来定量。
IFN既可用抗病毒检测技术〔Journal of Virology，37，755(1981)〕也可用酶免疫检测技术〔Journal of Immunology，80，55(1985)〕检测。具有N末端蛋氨酸的IFN相对于生产的全部IFN的比例由下述步骤确定从细胞中提取出IFN蛋白并用适当的方法纯化，例如IFN-αA的纯化样品，进行FPLC，从而将具有N末端蛋氨酸的分子和设有N末端蛋氨酸的分子分离，然后根据两者在280nm处吸收的比例进行计算。对于IFN-γ，两种分子的数量是根据丹磺酰化法或用肽顺序仪所确定的N末端蛋氨酸的含量表示。
根据本发明制备的蛋白质在从培养细胞里提取过程中，培养后的细胞采集起来并悬浮于含有盐酸胍一类的蛋白变性剂的缓冲液中，在冷处搅拌后用离心分离法收集含有蛋白质的上清液。根据另一种方法，细胞悬浮于缓冲液中用超声破碎，溶菌酶处理和(或)冻融法破碎然后用离心分离法收集含有蛋白质的上清液。也可使用其他任何适宜的方法。
从上述上清液中可分离出蛋白质并用适宜的已知的分离和纯化的方法相结合而纯化。这类已知的分离和纯化的方法是有效地利用溶解度差异的方法，例如盐析与溶媒沉淀;主要利用分子量差异的方法，例如透析法，超滤法，凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法;利用电荷差异的方法，例如离子交换层析法;根据特异亲和性的方法，例如亲和层析法;根据疏水性差异的方法，例如反相高效液层析法;以及利用等电点差异的方法，例如等电聚法。特别是人IL-2蛋白，具有高疏水性，可通过疏水柱层析，尤其是通过利用反相型柱子的高效液层析法而非常有效地纯化。对于IFN-α和IFN-γ，用能分别与IFN分子专一性结合的单克隆抗体的纯化方法是极其有效的。
当上述IL-2蛋白是Ala-IL-2和Met-Ala-IL-2混合物时，正如所需要的那样，AIa-IL-2可用根据象在PCT/JP84/00460(国际申请日期1984年9月26日)申请中那样由同一申请人揭示的等电点差异的分离方法分离之。
作为根据等电点差异的分离手段，可应用任何能分离相互等电点中有约0.01-0.2差别的蛋白质的方法，例如用两性电解质载体的密度梯度等电聚焦法，凝胶等电聚焦法，恒速电泳法或在电场中蛋白质电泳的类似方法，层析聚焦法(Chromatofocusing)，FPLC(快速蛋白液相层析法)，PH梯度DEAE-(二乙氨乙基)和CM(羧甲基)离子交换柱层析法或从一具有PH梯度的柱中依次洗脱蛋白质的类似方法，或者某些其他已知的方法，或它们的综合体。这些分离方法中所用的试剂和装置全是市售的并肯定能买到的。
如果需要的话，Cys-IFN-α和Met-Cys-IFN-α的混合物也可经同样处理使组份互相分离。
这样纯化了的没有对应于转译起始密码子ATG的N末端蛋氨酸残基的蛋白质具有与对应已知蛋白质相同的生理学活性，例如对应的天然存在的蛋白质，并能用于制药。
象已知的IL-2分子一样，Ala-IL-2蛋白可导致能够识别并破坏肿瘤抗原的抗原专一性杀伤T细胞或不经过致敏作用就能杀伤肿瘤的天然杀伤细胞的体外选择性生长。鉴于上述IL-2与杀伤细胞同时引入进一生物器官中使杀伤细胞的抗肿瘤活性增强，上述蛋白质可用于温血动物(例如，小鼠，大鼠，兔，狗，猫，猪，马，羊，牛和人)肿瘤的预防和治疗或免疫缺乏症的治疗。
至于用作抗肿瘤预防或治疗剂的上述Ala-IL-2蛋白，可以针剂或胶囊的形式不经肠胃或口服应用，例如用具有已知载体稀释而制备的制剂。此外，还可单独或联合使用按上述方法体外生长的杀伤T细胞或天然杀伤细胞。
实际上上述Ala-IL-2蛋白具有与已知天然分离的人IL-2相同的生物学活性，并因此可以与后者相同的方式使用。因为它与细胞IL-2受体的解离常数很小，所以服用极少量的上述蛋白质就足够了。
具有抗病毒，抗肿瘤，抑制细胞增殖，强化免疫及其他活性的IFN可用于治疗病毒感染和肿瘤，尤其是哺乳动物(例如，人，牛，马，猪，小鼠，大鼠)。在将上述IFN用作抗病毒，抗肿瘤，抑制细胞增殖或免疫作用强化剂中，上述IFN与已知的药理学可接受的载体，赋形剂或稀释剂混合并以不经胃肠道的静脉或肌肉注射的形式用药。常人日服用量在十万到一亿单位范围内，优选100万到5千万之间。非人哺乳动物的剂量范围为2，000到2，000，000单位/kg/天，优选20，000到1，000，000单位/kg/天。
图1示人IL-2的氨基酸序列。
图2示为人IL-2编码的DNA碱基序列的一例。
图3示人IFN-αA的氨基酸序列。
图4示人IFN-γ的氨基酸序列。
图5和图6分别表示参考实施例中所描述的质粒PTFl和PTB285的构建图解。
实施例
下列实施例和参考实施例更详细地说明了本发明。
实施例中所披露的转化菌株贮存在发酵研究所(FRI)，工业科技署，国际工贸部，发酵学院，大阪(IFO)，表2示贮存号。
表2
贮存 FRI IFO CGMCC
转化菌株 (贮存日期)
大肠杆菌 FERM BP-852
IFO-14437 039
N4830/PTB285 (1985年4月30日)
大肠杆菌 FERM BP-628
IFO-14299 0001
DH1/PTF4 (1984年4月6日)
大肠杆菌 FERM BP-967
IFO-14422 0086
C-4/PTF4 (1985年2月16日)
实施例1
参考实施例1(ⅱ)中所得的大肠杆菌N4830/PTB285接种于50ml往L培养基(细菌用胰化胨50g/l，细菌用酵母膏5g/l，氯化钠5g/l)中加入了50mg/l的氨苄青霉素钠和15mg/l的四环素盐酸盐而制得的培养基中，随后在摇床上于37℃培养过夜。液体培养基转移到含有2.5升改良M-9培养基的5升发酵罐中，该培养基含有表3中特别给出的一种或数种金属盐，培养开始时通气量为2.5升/分，搅拌速度为1000rpm，温度为30℃。培养过程中，当生长达到1000克莱特单位时，温度升高到42℃，继续培养4小时后，采集细胞并冷冻之。对于每个液体培养基，检验冷冻细胞的Ala-IL-2的产率。所得结果在表3中给出。
表3
加入各种金属离子的效果
加入的金属离子＊1(moles) Ala-IL-2
Mn++Fe+++Cu++Zn++Ca++Co++产率＊2
0 0 0 0 0 0 100
4×10-54×10-42×10-53×10-57×10-52×10-5500
4×10-50 0 0 0 0 470
0 4×10-40 0 0 0 320
4×10-54×10-40 0 0 0 570
＊1金属离子分别以下列形式加入
MnSO4·4-6H2O，FeCl3·6H2O，CuSO4·5H2O
ZnSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，CoCl2·6H2O
＊2产率按不加入金属离子的情况为100的相对数值给出。
从表3中可明显看出，Mn++和(或)Fe+++的加入导致了Ala-IL-2产率的显著增长，同时其它离子(Cu++，Zn++，Ca++，Co++)的加入对产率没有任何进一步的改善。
实施例2
大肠杆菌N4830/PTB285菌株以与实施例1相同的方式生长于含有不同浓度Mn离子的M-33培养基中，所得结果示于表4。
表4
加入锰离子的效果
MnSO4·4-6H2O(moles) Ala-IL-2产率＊
0 100
2×10-5310
4×10-5490
8×10-5600
2×10-4360
＊培养基中没加入金属盐的产率为100。
实施例3
大肠杆菌N4830/PTB285菌株以与实施例1相同的方式培养于含有不同浓度的Fe离子的培养基中，所得结果示于表5
表5
加入铁离子的效果
FeCl3·6H2O(moles) Ala-IL-2产率＊
0 100
7×10-5370
4×10-4410
＊培养基中没加入金属盐的产率为100。
实施例4
大肠杆菌DH1/PTF4转化菌株〔Japanese Patent Application No.225079/1983年11月28日申请，以Japanese Patent Application No.115528/1985公开，实施例3〕接种于50ml往L培养基中加入了7mg/l的四环素盐酸盐的液体培养基(PH7.0)中，然后在摇床上于37℃下培养过夜。液体培养基接种于含有2.5升改良M-9培养基或补充了4×10-4摩尔的FeCl3·6H2O和4×10-5摩尔的MnSO4·4-6H2O的相同培养基的发酵罐中，培养起始的通气率为2.5升/分，搅拌速率为1000rpm，温度为37℃。培养过程中，当生长达到500克莱特单位时温度降至30℃，当生长达到1000克莱特单位时，温度降到25℃。培养24小时之后，采集细胞并冷冻，从细胞中提取IL-2确定Ala-IL-2产率。所得结果示于表6。
表6
金属离子(moles) Ala-IL-2产率＊
Mn++Fe+++
0 0 100
4×10-54×10-4230
＊培养基中没加入金属离子的产率为100。
实施例5
大肠杆菌N4830/PTB285接种于六个250ml锥形瓶中，每一瓶中都有50ml含有50mg/l的氨苄青霉素的L液体培养基(PH6.0)，随后在摇床上于30℃下培养过夜。125ml的液体培养基接种于含有50mg/l的氨苄青霉素钠的2.5升M-33培养基〔培养基(A)〕和2.5升含有50mg/l的氨苄青霉素钠，8×10-5摩尔的MnSO4·4-6H2O和4×10-4摩尔的FeCl3·6H2O的M-33培养基〔培养基(B)〕中，培养起始的通气量为2.5升/分，搅拌速率为1000rpm，温度为30℃，全部培养过程的PH用氨水保持在6.5。每当葡萄糖浓度降至0.5%以下时，就加入葡萄糖和酪蛋白氨基酸，每次相当于1%的量。此外当生长达到1000克莱特单位时，温度升高到42℃。温度改变后的4小时之后培养完成，离心分离每一液体培养基，采集细胞在-80℃下冷冻贮存。
取每种液体培养基的冷冻细胞各12g，均匀悬浮于100ml含有7M盐酸胍和0.1MTris-HCl缓冲液的提取剂(pH7.0)中。4℃搅拌1小时后，悬浮液在28，000×g下离心20分钟分离上清液。
这样得到的每一种上清液在0.01MTris-HCl缓冲液(PH8.5)中透析，并在19，000×g下离心10分钟。这样得到的上清液过用Tris-HCl缓冲液(PH8.5)平衡的DE52(DEAE-cellulose，Wattman，Great Britain)柱(体积为50ml)使蛋白质吸附。通过建立一线性NaCl浓度梯度(0-0.15M NaCl，1升)，IL-2洗脱下来给出活性部分。
上述这样得到的每个活性部分用YM-5膜(Amicon，USA)浓缩至约5ml，浓缩液用由0.1M Tris-HCl(PH8.0)-1M NaCl缓冲液平衡的Sephacryl S-200(Pharmacia，Sweden)柱(体积为500ml)进行凝胶过滤。体积约为30ml的每一种活性部分用YM-5膜浓缩至约2.5ml。浓缩液加于Ultrapore RPSC(Altex，USA)柱吸附，继之以三氟乙酸-乙腈系统作洗脱剂进行高效液相层析。Ultraporo RPSC柱(4.6×75mm);柱温30℃;洗脱剂A，0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脱剂B，0.1%三氟乙酸-99.9%乙腈;洗脱程序，0分(68%A+32%B)-25分(55%A+45%B)-35分(45%A+55%B)-45分(30%A+70%B)-48分(100%B);洗脱速率0.8毫升/分;检测波长230nm。
对每一培养物，收集到大约10ml在上述条件下保留约39分钟后洗脱下的活性片段。
这样得到的含有Ala-IL-2和Met-Ala-IL-2混合物的每一份液体冻干，冻干物溶解于5ml0.005M醋酸铵缓冲液(PH5.0)中，加于用0.025M二乙醇胺盐酸缓冲液(PH9.4)平衡的Mono P FPLC柱(0.5×20mm，Pharmacia)上然后用1%(V/V)Pharmalite(PH8-10.5)-5.2%(v/vPolybuffer96盐酸缓冲液(PH8.0)洗脱吸附在Mono P柱上的蛋白质。FPLC在室温下进行，流速为30毫升/小时。对每一培养物，收集17-19ml活性洗脱部分并用三氟乙酸-乙腈系统作洗脱剂进行高效液相层析除去Polybuffer。Ultrapore RPSC柱(1.0×25cm，Altex);柱温，洗脱剂A和洗脱剂B同上;洗脱程序，0分(55%A+45%B)-4分(55%A+45%B)-28分(42%A+58%B)-38分(34%A+66%B)-43分(20%A+80%B)-44分(55%A+45%B);洗脱速率为3.0ml/分。
这样得到的每一Ala-IL-2部分冻干成白色粉末。
从没有加入任何金属盐的培养基(A)中得到的上述粉末重1.53mg，同时有金属盐的培养基(B)得到了6.31mg的粉末。
利用这两个样品，N末端氨基酸按自动埃德曼降解法用气相蛋白序列分析仪(Applied Biosystems 470A型)而鉴定出来，并证实了丙氨酸的量在98%以上。同时进一步证实了其它蛋白质的化学性质(C末端氨基酸，氨基酸组成分析，肽图)相当一致。
实施例6
大肠杆菌294(ATCC31446)/PLeIF-A-Trp25菌株〔cf.Example.l of EPC(laid open)No.43980〕携有插入了编码如图3所示氨基酸序列的人IFN-αA基因的表达质粒，接种于50ml的培养基中，培养基是往L培养基中加入了5mg/l的四环素盐酸盐而制得的，随后在摇床上于37℃培养过夜。培养液转移到容纳了2.5升补充了一或数种表7列出的金属盐类的改良M-9培养基的5升发酵罐中。培养开始时通气量为2.5升/分，搅拌速率为1000rpm，温度37℃。生长到500克莱特单位时温度降至30℃，1000克莱特单位时再降至25℃。以这种方式培养24小时。培养过程中，每当葡萄糖浓度低于0.2%时，就加入1%量的葡萄糖。培养后离心分离每一份培养液，同时收集细胞，悬浮于100ml50mM Tris-HCl缓冲液(PH7.6)中，该缓冲液含有10%葡萄糖，0.2M NaCl，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，10mM亚精胺，2mM苯甲基磺酰氟和0.2mg/ml溶菌酶。4℃搅拌1小时后，悬浮液于37℃保温5分钟，然后再用超声破碎器(Altex，USA)于0℃处理40秒钟。所得溶胞产物在11，300×g下离心1小时得到95ml上清液。
该上清液(95ml)用300ml含有1mM EDTA和0.15M NaCl的20mM Tris-HCl(PH7.6)缓冲液(TEN)稀释，稀释液加于抗IFN-αA抗体柱(20ml)上。
TEN充分洗涤该柱后，用含有0.1%Tween20(Wako Pure Chemical Indurtries)的0.2M醋酸洗脱IFN-αA，收集的活性组分调到PH4.5并加在CM纤维素柱上吸附。充分洗柱之后，用含有0.15M NaCl的0.025M醋酸铵缓冲液(PH5.0)进行洗脱。这样再次获得的活性组分冻干，得到下表中给出数量的人白细胞IFN-αA粉末。
这样得到的每一样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上得到一条单一的条带，分子量19，000±1，000，抗病毒活性2-3×108U/mg。所得样品利用层析聚焦Mono P柱，用PH从6.7到5.5的Polybuffer进行FPLC，由此确定具有N末端蛋氨酸与没有该蛋氨酸的分子的比例。结果示于表7。因此，锰和(或)铁离子的加入实际上导致了没有N末端蛋氨酸的分子的产生。
表7
加入的金属离子(摩尔) IFN-αA粉 含有N末端蛋
Mn++Fe+++产量(mg) 氨酸分子比例
0 0 28 14.6%
4×10-50 29 0.8%
0 7×10-530 1.0%
4×10-57×10-532 低于0.5%
实施例7
携有按Japanese Patent Publication(laid open)No.189197/1983的实施例8中所描述的嵌有为图4所示氨基酸序列编码的人IFN-γ基因的表达质粒的大肠杆菌RR-1(pRK248cIts，PRC231/IFN-900)接种于50ml加入了50mg/l的氨苄青霉素钠和10mg/l的四环素盐酸盐而制得的培养基中，随后在摇床上于30℃培养过夜。培养液转移到容纳了2.5升含有一或数种表8中给出的金属盐的M-33培养基的5升发酵罐中。培养开始时的通气量为2.5升/分，搅拌速率为1000rpm，温度为30℃。在对数生长期，当生长到700克莱特单位时，加入葡萄糖和酪蛋白氨基酸，每一种的量相当于1%的浓度，同时培养温度从30℃升高到42℃，然后继续培养4小时。每当葡萄糖浓度于0.2%时就加入葡萄糖和酪蛋白氨基酸，每一种的量相当于1%的浓度。
完成培养后离心培养液，收集细胞，冷冻贮存。
每一具有300ml含7M盐酸胍的100mM Tris-盐酸缓冲液(PH7.0)的培养物中100g冷冻细胞的提取物进行离心分离，得到上清液。该上清液用含有137mM氯化钠，27mM氯化钾，8mM磷酸氢二钠和147mM磷酸二氢钾的缓冲液(下文中简称P·B·S·)稀释70倍，稀释液再离心得到清亮透明的上清液。该上清液加在单克隆抗体〔γ2 111·1MoAb;Japanese Patent Publication(laid open)No.80646/1984〕柱(50ml)上，充分洗涤后，用含有2M盐酸胍的20mM磷酸缓冲液(PH7.0)进行洗脱。收集活性组分走Sephacryl S-200(Pharmacia)柱，然后再走Sephadex G-25柱，每种情况下都收集活性组分，由此得到纯化的IFN-γ样品。各自培养基的产量示于表8。
得到的每一样品都显示了不低于95%的IFN-γ的纯度和3-4×106IU/mg的抗病毒活性。样品丹磺酰化，分离丹磺酰蛋氨酸并用FPLC定量。具有N末端蛋氨酸的分子相对于全部分子的比例由此而得到，所得数据示于表8。
表8
加入的金属离子(摩尔) IFN-γ 具N末端Met
Mn++Fe+++产量(mg) 分子的比例
0 0 15 12.0%
4×10-50 16 1.0%
0 7×10-516 1.2%
4×10-57×10-517 低于1%
因此，铁和锰离子的加入实际上导致了效果良好的不含有伴随的N末端蛋氨酸的分子的IFN-γ的产生。
实施例8
参比实施例2所得的大肠杆菌C-4/PTF4接种于往L培养基中加入5mg/l的四环素盐酸盐而制得的培养基中，随后在摇床上(200rpm)于37℃培养16.5小时。125ml培养液分别接种于5升发酵罐中的2.5升(1)调到PH5.5的M-0.3培养基和(2)含有20mg/l FeCl3·6H2O和MnSO4·4-6H2O的培养基中，随后于34.5℃下培养，通气量2.5升/分并搅拌，用14%氨水和5N硫酸保持PH5.5。培养过程中，当生长达到约500克莱特单位时，温度降至27.5℃，当生长达到约1000克莱特单位时为22.5℃。每6个小时之后，加入2g/l的葡萄糖和2g/l的酪蛋白氨基酸。培养24小时后，检测培养液中产生的Ala-IL-2，得到如表9中所示的结果。
从培养液中收集细胞并从各自的12g冷冻细胞中提取出IL-2并按实例5中所述的相同的方式纯化Ala-IL-2。分别从培养基(1)和培养基(2)里生长的细胞中得到2.1mg和10.0mgAla-IL-2。
表9
金属盐 Ala-IL-2产率
- 100
FeCl3·6H2O 20mg/l
MnSO4·4-6H2O 10mg/l 509
参比实施例1产生人IL-2转化菌株(Ⅰ)的制备
(ⅰ)含有人IL-2基因的质粒PILOT135-8〔Japanese Patent Application No.225079/1983，1983·11·28申请，并以Japanese Patent Publication No.115528/1985公开;见Example 1(vii)thereof〕用限制性内切酶HgiAⅠ酶切。得到的1294 bp DNA片段用T4DNA聚合酶使之末端钝化，并用T4DNA连接酶连接在EcoRI连接子dTGCCATGA ATTCATGGCA上。这样得到的DNA用EcoRⅠ酶解得到了具有转译起始密码子ATG和人IL-2基因的DNA片段。
这个DNA片段嵌入预先在EcoRⅠ-PstⅠ位点上用T4DNA连接酶酶解过的质粒Ptrp781〔Nucleic Acids Research，11，3077(1983)〕中。这样得到的表达质粒PTF1具有转译起始密码子和色氨酸启动子下游的人IL-2基因(图5)。
质粒PTF1用限制性内切酶StuⅠ酶解，随后用BamHⅠ连接子连接。得到的质粒DNA用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ处理，EcoRⅠ和BamHⅠ片段嵌入含有λPL启动子的质粒PTB281中。这样得到的表达质粒称作PTB285(图6)。
(ⅱ)大肠杆菌N4830通过Cohen et al方法〔Proceedings of National Academy of Sciences USA，69，2110(1972)〕用上述制得的质粒PTB285转化，由此得到大肠杆菌N4830/PTB285转化体。
参比实施例2产生人IL-2转化菌株(Ⅱ)的制备
具有人IL-2结构基因的表达质粒PTF4根据Birnboim，H·C·et al·方法〔Nucleic Acids Research，7，1513(1979)〕从大肠杆菌DH1/PTF4〔European Patent Publication(laid open)No.145390〕中分离出来。利用上述质粒，用Cohen S·N·et al·方法〔Proceedings of National Academy of Science，USA，69，2110(1972)〕转化大肠杆菌PRβ〔J.Bacteorogy，97，1522(1969)〕。得到的转化株细胞接种于具有1%细菌用胰化胨(Difco Laboratories，USA);0.5%细菌用酵母膏(同上)，0.5%氯化钠和5mg/l四环素盐酸盐的，在200ml锥形瓶中的培养基中(50ml，PH7.0)，然后在37℃下培养一夜。得到的每一培养液随后接种于含有往改良M-9培养基中加入1mg/l维生素B1盐酸盐而制得的30ml培养基的200ml锥形瓶中，在37℃继续培养4小时后30℃再4小时，25℃下10小时;筛选出具有极高IL-2产率的菌株，即E·coli C-4/PTF4。
权利要求
1、一种生产蛋白质的方法，培养具有一个表达载体的大肠杆菌，该载体在转译起始密码子下游有为该蛋白质编码的结构基因，该方法包括在含有(1)铁离子来源，锰离子来源或其混合物和(2)天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌，增加在N末端没有与转译起始密码子ATG相对应的蛋氨酸的蛋白质产量。
2、根据权项1的方法，其中的蛋白质是选自由细胞素，转化生长因子，肽蛋白激素，病原微生物抗原蛋白质，酶和血清蛋白质组成的一组生理活性蛋白质。
3、根据权项2的方法，其中的细胞素是干扰素或白细胞介素。
4、根据权项3的方法，其中的干扰素是干扰素α或干扰素β。
5、根据权项3的方法，其中的白细胞介素是白细胞介素2。
6、根据权项1的方法，其中的表达载体含有一启动子。
7、根据权项6的方法，其中的启动子是λPL启动子。
8、根据权项6的方法，其中的启动子是色氨酸启动子。
9、根据权项1的方法，其中的铁离子来源是铁盐。
10、根据权项9的方法，其中的铁盐是三价铁的无机酸盐。
11、根据权项1的方法，其中的锰离子来源是锰盐。
12、根据权项11的方法，其中的锰盐是无机酸盐。
13、根据权项1的方法，其中的培养基含有从10-6到10-3摩尔浓度的铁离子。
14、根据权项1的方法，其中的培养基含有浓度为10-6到10-3摩尔的锰离子来源。
15、根据权项1的方法，其中的培养基含有总浓度为10-6到10-3摩尔的锰离子和铁离子的混合物。
16、根据权项1的方法，其中的天然来源的氮源选自酪蛋白氨基酸，蛋白胨，酵母膏和麦芽汁。
17、根据权项16的方法，其中的氮源是酪蛋白氨基酸。
18、根据权项1的方法，其中的培养基含有浓度为1g/l到50g/l的氮源。
19、根据权项1的方法，其中的培养在酸性条件下进行。
20、根据权项7的方法，其中的培养在增殖期于25到35℃温度下进行，然后升温至约42℃。
21、根据权项8的方法，其中的生长保持在温度约37℃下进行到生长的中期，随后根据繁殖的情况降温到20至30℃。
专利摘要
本发明提供了一种用培养具有表达载体的大肠杆菌生产蛋白质的改进的方法，该载体在转译起始密码子的下游具有蛋白质的结构基因，该方法包括在含有(1)铁离子，锰离子或其混合物和(2)天然来源的氮源的培养基中培养大肠杆菌以增加在N末端没有与转译起始密码子ATG相对应的蛋氨酸的蛋白质产量。 根据本发明的方法，可得到高产量的没有与转译起始密码子ATG相对应的N末端蛋氨酸的蛋白质。
文档编号A61K38/00GK86102977SQ86102977
公开日1986年10月29日 申请日期1986年4月29日
发明者北野一昭, 藤本茂 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan