专利名称：：焦磷酸传感器以及使用该传感器的snp分型传感器的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种简便且高灵敏度地测定试样溶液中的焦磷酸的传感器、以及使用该传感器的SNP分型传感器。
背景技术：
：已知焦磷酸参与细胞内的酶反应。例如，在蛋白质的合成过程中，在氨基酸经氨酰基腺苷酸形成氨酰基tRNA的反应中，生成焦磷酸。又如，在植物等中发现的淀粉合成的过程中，通过葡萄糖-l-磷酸与ATP的反应生成ADP-葡萄糖时，生成焦磷酸。除此之外，还知道，在各种酶反应中，焦磷酸均参与。因此，定量检测焦磷酸的技术，在分析细胞状态或者上述的酶反应等方面上是重要的技术。作为现有技术的焦磷酸测定方法，已知Grindley等的化学方法(参照非专利文献l)。然而，因为此方法使用浓硫酸，所以不优选。在专利文献1中，公开了不使用浓硫酸等化学药品而利用酶的三种焦磷酸测定方法。以下说明这三种焦磷酸测定方法。第一种方法，是一种在磷酸烯醇丙酮酸和腺苷一磷酸的存在下、使丙酮酸邻磷酸二激酶作用于焦磷酸的方法。因为此反应生成丙酮酸，所以通过测定丙酮酸的量，能够算出焦磷酸的量。另外，测定焦磷酸的量的方法提案有两种方法。一种是当利用乳酸脱氢酶的催化作用而用NADH还原丙酮酸时，比色定量NADH的减少的方法。另一种是使丙酮酸氧化酶作用于生成的丙酮酸，再将生成的过氧化氢引导到色素中，由此进行比色定量的方法。第二种方法，是一种在胞苷二磷酸甘油的存在下，使甘油-3-磷酸胞苷酰基转移酶作用于焦磷酸的方法，由该反应生成甘油三磷酸。因此，通过测定甘油三磷酸的生成量，能够算出焦磷酸的量。测定甘油三磷酸的量的方法提案有两种方法。一种是当利用甘油-3-磷酸脱氢酶的催化作用而用NAD(P)+氧化甘油三磷酸时，比色定量NAD(P)H的增加的方法。另一种是使甘油-3-磷酸氧化酶作用于生成的甘油三磷酸，将生成的过氧化氢导入色素中，从而进行比色定量的方法。第三种方法，是一种在胞苷二磷酸核糖醇的存在下、使核糖醇-5-磷酸胞苷酰基转移酶作用于焦磷酸的方法。因为此反应生成D-核糖醇-5-磷酸，所以通过测定其生成量，能够算出焦磷酸的量。测定D-核糖醇-5-磷酸的方法已提案有在NAD"^(或者NADP+)的存在下，使核糖醇-5-磷酸脱氢酶作用进而比色定量NADH(或者NADPH)的增加。作为其它的技术方案，专利文献2还公开了下述方法利用焦磷酸酶，在磷酸中水解焦磷酸后，利用嘌呤核苷磷酸化酶，使磷酸与次黄嘌呤核苷或者黄嘌呤核苷反应，利用黄嘌呤氧化酶，氧化所生成的次黄嘌呤，生成黄嘌呤，再氧化，生成尿酸。在利用该黄嘌呤氧化酶的氧化过程中，利用过氧化物酶，对生成的过氧化氢，使发色剂发色。然而，在这些焦磷酸的测定方法中，为了测定样品的吸光度或发色，需要使用含有光学系的较大装置。另一方面，核酸的延伸反应也是焦磷酸参与的重要的生物反应之近年，一直盛行开发有关基因信息的技术。在医疗领域，通过分析与疾病相关的基因，能够实现对疾病在分子水平上的治疗。另外，根据基因诊断，也能够实现对应于每个患者个人的对症(tailor-made)医疗。在制药领域，利用基因信息，确定抗体和激素等的蛋白质分子，并将它们作为药品利用。在农业和食品领域等，也已制造许多利用了基因信息的制品。这些基因信息中，基因多态性特别重要。正如我们的脸和体型等各种各样，每个人的基因信息的相当一部分都不同。将这些遗传信息的差异之中、碱基序列的变化以人口的1%以上的频度存在的称为基因多态性。已知，这些基因多态性，不仅与个人的脸型关联，而且与各种基因疾患的原因、体质、药剂反应性、药剂的副作用等关联，现在，正急速调查该基因多态性与疾病等的关联。该基因多态性中，近年，最引人注目的是SNP(Singlenucleotidepolymorphism;单核苷酸多态性)。SNP，意指在基因信息的碱基序列中，仅有一个碱基存在差异的基因多态性。SNP，已知在人基因组DNA内有23百万，作为基因多态性的标记容易被利用、并期待被应用于临床。现在，作为SNP关联技术，正在进行基因组中的SNP的位置鉴定以及SNP与疾患的关联性等的研究，同时，还在进行识别SNP位点的碱基的SNP分型技术的开发。SNP分型的技术，有利用杂交的技术、利用限制性内切酶的技术、利用连接酶的技术等各种技术。这些技术中，最简便的技术是利用引物延伸反应的技术。该技术，通过判定引物延伸反应是否发生，进行SNP分型。针对利用了引物延伸反应的SNP分型技术的检测，已设计出使用荧光色素检测实际的DNA的扩增产物的方法、使用固定化探针的方法，除此之外，还设计出检测作为利用DNA聚合酶合成核酸的副产物的焦磷酸的方法。关于该方法，为了检测延伸反应的进行的差，将伴随引物延伸反应的进行而产生的焦磷酸转换为ATP，然后采用了利用荧光素酶反应测定焦磷酸的量的方法(参照非专利文献2)。专利文献3还公开了下述的方法通过测定焦磷酸，高灵敏度地测定试样液中的目的核酸的方法、简便地分型SNP的方法。根据专利文献3公开以下方法向包含具有与DNA的SNP序列互补的序列、且具有SNP位点的DNA探针、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸的反应体系中，提供试样，通过PCR(PolymeraseChainReaction:聚合酶链式反应)反应，使DNA探针延伸，利用焦磷酸酶，将伴随DNA探针的延伸反应而生成的焦磷酸转换为无机磷酸，在利用含有甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶和作为电子媒介体的铁氰化钾的测定体系，最终在电极上测定电流，由此分型DNA的SNP序列。如专利文献3所述，如果采用此方法，则能够在将含有焦磷酸的试样加入测定体系之后、100秒以内识别SNP序列。该方法，通过电化学测定电子媒介体的氧化还原反应，能够进行焦磷酸的测定和SNP的分型，并作为一种不需要光学体系的简便且高灵敏度的方法被公开。这种焦磷酸的测定和SNP的分型，通过在传感器基板上干燥载持所需要的试剂，能够使传感器芯片小型化，还能够以非常简便的操作进行测定。专利文献4公开在试剂干燥载持型的生物传感器中，同时载持缓冲剂成分和酶的情况下，通过分离配置二者，能够防止酶活性的降低。专利文献1:特开昭61—12300号公报专利文献2:特开2002—369698号公报专利文献3:国际公开第03/078655号小册子专利文献4:特开平7—83872号公报非专利文献1:G.B.GrindleyandC.A.Nichel,Anal.Biochem,.Vol33.p114(1970)非专利文献2:J.ImmunologicalMethod，156，55-60，199
发明内容然而，上述的焦磷酸的测定以及应用该测定技术的SNP分型具有如下问题因为更进一步地使用多种试剂，所以仅仅通过分离配置缓冲液成分和酶、并干燥载持，不能呈现稳定的特性。本发明是为了解决上述问题而提出的发明，其目的在于提供一种简便且高灵敏度地检测试样溶液中的焦磷酸的传感器、以及使用该传感器的SNP分型传感器。为了达到上述目的，本发明具有以下的特征。S卩，本发明提供一种焦磷酸传感器，其特征在于，具有绝缘性的基板；在上述绝缘性的基板上形成的至少包括测定电极和对电极的电极系；在上述基板上设置的由焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、电子媒介体、镁盐和缓冲液成分构成的多个反应试剂层，含有上述酶的反应试剂层与含有上述缓冲液成分的反应试剂层分离，含有甘油醛-3-磷酸的反应试剂层与含有缓冲液成分的反应试剂层分离。本发明的特征还在于含有上述甘油醛-3-磷酸的反应试剂层还与含有酶的反应试剂层分离。本发明的焦磷酸传感器，其特征还在于含有上述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应试剂层与含有上述酶的反应试剂层、含有上述缓冲液成分的反应试剂层、含有上述甘油醛-3-磷酸的反应试剂层分离。本发明的特征还在于上述反应试剂层分别形成在上述绝缘性基板上的被分离的部分。本发明的特征还在于上述反应试剂层叠层形成在上述绝缘性基板上的同一部分。本发明的特征还在于上述反应试剂层叠层形成在上述测定电极上。本发明提供一种SNP分型传感器，其特征在于，包括绝缘性的基板；在上述绝缘性的基板上形成的至少包括测定电极和对电极的电极系；以包围上述电极系的方式设置在上述基板上的测定腔室；设置在上述基板上的反应腔室；连接上述测定腔室与上述反应腔室的流路，在上述测定腔室内具有由焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、电子媒介体、镁盐和缓冲液成分构成的多个反应试剂层，并且含有上述酶的反应试剂层与含有上述缓冲液成分的反应试剂层分离，含有甘油醛-3-磷酸的反应试剂层与含有缓冲液成分的反应试剂层分离。本发明的特征还在于含有上述甘油醛-3-磷酸的反应试剂层还与含有酶的反应试剂层分离。本发明的特征还在于含有上述氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应试剂层与含有上述酶的反应试剂层、含有上述缓冲液成分的反应试剂层、含有上述甘油醛-3-磷酸的反应试剂层分离。本发明的特征还在于在上述反应腔室中进行DNA扩增反应。本发明的特征还在于上述DNA扩增反应为PCR反应。发明的效果根据本发明的焦磷酸传感器，能够提供一种简便且高灵敏度地测定试样溶液中的焦磷酸的传感器、以及使用该传感器的SNP分型传感器°图1为表示本发明一种实施方式涉及的电极基板的结构的立体图。图2为表示本发明一种实施方式涉及的电极基板的结构的立体图。图3为表示本发明一种实施方式涉及的外罩(housing)基板的结构的立体图。图4为表示本发明一种实施方式涉及的焦磷酸传感器的结构的立体图。图5为表示本发明一种实施方式涉及的焦磷酸传感器的结构的立体图。图6为表示本发明一种实施方式涉及的SNP分型传感器的结构的立体图。图7为表示本发明一种实施方式的结果的曲线图。符号说明1绝缘基板2测定电极3对电极4参照电极5导电性图案6端子部7电极基板21绝缘膜31外罩基板32腔室33注入孔34空气孔35第一反应试剂层36第二反应试剂层37第三反应试剂层38第四反应试剂层41测定腔室42PCR腔室43流路具体实施例方式以下，参照本发明的实施方式。(实施方式1)图1为表示本发明一种实施方式的电极基板的立体图。在绝缘基板1上形成有测定电极2、对电极3、参照电极4。每个电极可以选自金、铂、钯等贵金属和碳等，然而，从表面状态的稳定性等观点考虑，优选选择金。参照电极4，从溶液中的电位的稳定性考虑，更优选使用显示不分极性的参考电极。从操作的简便性等考虑，优选银-氯化银电极。银-氯化银电极的形成方法可以列举下述方法在用金和铂等形成的电极图案的参照电极4位点上进行镀银，在氯化钠水溶液中施加电压，对表面氯化银化的方法；使用银-氯化银糊材料构成电极主体的方法；使银糊的表面与次氯酸钠等的水溶液接触的方法等。各电极通过导电性图案5，与作为连接外部电路的部分的端子部6电气结合。另外，从制造工序考虑，还优选导电性图案5和端子部6也使用与电极部分相同的材料形成。作为在绝缘基板1上形成电极和导电性图案的方法，考虑例如在绝缘基板1上的导电性材料的印刷、导电性材料的溅射或蒸镀后的采用光刻法的蚀刻或由激光的除去加工，使用掩膜的电极图案的直接溅射等。作为绝缘基板1，可以选择硅、锗等的半导体、石英玻璃、铅玻璃、硼硅酸玻璃等的玻璃、陶瓷、树脂等，然而，考虑作为可自由使用的生物传感器的用途时，从加工的容易程度和成本方面考虑，希望选择树脂材料。作为树脂材料，可以选择聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯硫醚(PPS)、聚醚醚酮(PEEK)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚2,6-萘二甲酸乙二酯(PEN)等。其中，采用溅射法形成金电极时，从与金的密合性的观点等考虑，优选选择PET。再者，作为绝缘基板1的厚度，从操作的容易程度等考虑，优选0.1mm2.0mm，最优选0.188mm1.0mm。电极基板7能够原样使用，然而，如图2所示，从电极部分的面积的规定以及导电性图案5的绝缘、保护的观点考虑，可以用绝缘膜21进行涂覆。作为绝缘膜21，可以在通过旋转涂布将例如聚酰亚胺等的树脂材料成膜后，采用以下的方法形成采用光刻法而仅使电极部分露出的方法，粘贴预先冲压出电极部分的粘合片的方法，印刷绝缘性糊材料的方法等。电极基板7不论有无绝缘膜21，均可通过载持试剂，作为焦磷酸传感器原样使用，然而，以防止测定溶液的干燥和污染为目的，可以如下所示地加外罩。图3为表示本发明一种实施方式的焦磷酸传感器的立体图，由图1所示的电极基板和图4所示的外罩基板构成。在本发明的生物传感器中使用的外罩基板31，必须选择与试样液不发生反应的材料，可以选择硅、锗等的半导体、石英玻璃、铅玻璃、硼硅酸玻璃等的玻璃、陶瓷、树脂等，然而，考虑作为可自由使用的生物传感器的用途时，从加工的容易程度和成本方面考虑，与绝缘基板1同样希望选择树脂材料。作为树脂材料，可以选择聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯硫醚(PPS)、聚醚醚酮(PEEK)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚2,6-萘二甲酸乙二酯(PEN)、环状烯烃共聚物(COC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。其中，PMMA和PC，透明性优良，能够确认内部试样的状态，微细的切削加工等容易进行，因此，特别优选。再者，要求耐热性时，特别优选PC。关于在外罩基板31上形成的腔室33的形成方法，外罩基板31为树脂材料时，可以进行切削加工，除此之外，可以采用模具的成型、热转印的压花加工等。还能够通过贴合具有贯通孔的薄片，形成腔室33。具有如此形成的腔室33的外罩基板31，与电极基板7粘合，然而优选外罩基板31与电极基板7完全地粘合或密合，密封腔室33内部的试样。为了粘合，例如可以使用丙烯酸类和环氧类、硅酮等的粘合剂、两面胶条等的粘合片等。另外，使用如聚碳酸酯之类的耐有机类溶剂性低的材料时，可以使三氯甲垸等的有机类溶剂流入外罩基板31与电极基板7的界面，通过加压，进行粘合。再者，使用PS和PMMA等的热塑性树脂时，也能够采用热熔合的方法。在外罩基板31上设置有用于向腔室32内部注入试样的试样注入孔33。虽然试样注入孔33至少有一个即可，但是如果作为空气的逸出孔设置空气孔34，则除试样注入时使用以外的空气孔34，可以作为腔室32内部的空气的逸出口发挥作用，而使试样快速地被注入，因此优选。注入孔33和空气孔34，只要与腔室32连接，其位置并不特别限制。如果对腔室32内部进行公知的亲水性处理，则试样能够更快速地被导入。虽然可以在注入试样后，采用胶条等的方法密封注入孔33和空气孔34，但是如果是短时间的测定，则可以在开口状态下使用。在腔室32的内部，载持含有缓冲液成分、电子媒介体、镁盐的第一反应试剂层35、含有焦磷酸酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶的第二反应试剂层36、含有甘油醛-3-磷酸的第三反应试剂层37、以及含有氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的第四反应试剂层38。正如从下述实施例能够理解的那样，从发现焦磷酸浓度与电流值的比例关系，并且使该比例关系的斜率更加增大的观点考虑，最优选如上所述地分成四个反应试剂层3538(参照实施例的样品D)。虽然上述斜率减小，但是可以在同一反应试剂层包含氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(第四反应试剂层38)和缓冲液成分、电子媒介体、镁盐(第一反应试剂层35)(参照实施例的样品C)。至少，在本发明中，不仅可以将焦磷酸酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶与缓冲液成分分离，而且也可以将甘油醛-3-磷酸与缓冲液成分分离。因此，如实施例的样品B所示，不仅可以在同一反应试剂层包含氧化型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(第四反应试剂层38)与缓冲液成分、电子媒介体、镁盐(第一反应试剂层35)，而且在同一反应试剂层包含甘油醛-3-磷酸(第三反应试剂层37)与焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及心肌黄酶(第二反应试剂层36)。但是，存在上述比例关系的明确性和上述斜率更加减小的倾向。作为电子媒介体，优选为水溶性且在氧化体中稳定的物质，例如，能够使用铁氰化钾。作为镁盐，可以是含有镁离子、水溶性且pH为中性弱碱性的物质，例如，可以使用氯化镁。可以使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，代替氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。还可以与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)—起，使用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)。本发明的说明书中，也将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸、它们的组合称为核苷酸类。第一反应试剂层35、第二反应试剂层36、第三反应试剂层37和第四反应试剂层38被载持的位置，可以是腔室32内部的任意地方，然而，如图3所示，第一反应试剂层35、第二反应试剂层36、第三反应试剂层37和第四反应试剂层38被载持在电极基板7上的被分离的位置上。向规定的位置上分别滴加含有一定量的各试剂的试剂溶液，通过常温真空干燥、温风干燥、冻结干燥等，使作为溶剂的水分蒸发，据此，可以进行各反应试剂层3538的载持。(实施方式2)图5表示本发明一种实施方式的焦磷酸传感器的立体图。如图5所示，在电极基板7上叠层载持有第一反应试剂层35、第二反应试剂层36、第三反应试剂层37和第四反应试剂层38。此时，为了不使第一反应试剂层35、第二反应试剂层36、第三反应试剂层37和第四反应试剂层38被混合，可以使用公知的技术。例如，当形成第一反应试剂层时，形成与羧甲基纤维素(CMC)之类的高分子材料的混合层，据此可以将第二反应试剂层36制成水溶性的薄膜状。接着，在第二反应试剂层36上形成聚乙烯吡咯垸酮(PVP)之类的亲水性高分子膜。接着，当形成第四反应试剂层38时，使试样溶解于PVP呈难溶性的甲苯之类的溶剂后滴加，据此可以与第一反应试剂层的成分不混合地形成第四反应试剂层38。通过反复进行相同的操作，可以使各反应试剂层的成分不混合地形成第三反应试剂层37和第四反应试剂层38。PVP膜由于呈水溶性，通过试样溶液的供给，各反应试剂层3538快速地混合。再者，在图3和图5中，虽然在电极基板7上分别载持各反应试剂层3538，但是只要是腔室32内部，可以在任意位置上载持，可以在外罩基板31的腔室32侧载持。(实施方式3)图6为表示本发明一种实施方式的SNP分型传感器的立体图。虽然该SNP分型传感器与图3同样地由电极基板7和外罩基板31构成，但是在外罩基板31上，除了设置有测定腔室41，还设置有PCR腔室42、以及用于连接测定腔室41与PCR腔室42的流路43。从注入孔33，与SNP分型测定对象的DNA试样液一起，注入包含具有与DNA的SNP序列互补的序列、且具有SNP位点的DNA探针、禾nDNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸的反应体系，当通过用加热器等在PCR腔室42内实施温度循环而进行PCR反应时，SNP分型测定对象的DNA的SNP位点与具有SNP位点的DNA探针互补时，可以使DNA探针延伸，并且生成焦磷酸。另一方面，SNP分型测定对象的DNA的SNP位点、与具有SNP位点的DNA探针非互补时，则不进行DNA探针的延伸，并且不生成焦磷酸。其后，当使PCR反应结束后的试样液通过流路43移动至测定腔室41时，可以进行对应于SNP分型的焦磷酸的定量，从而能够进行测定对象的DNA的SNP分型。再者，只要在反应腔室42内载持包含具有与DNA的SNP序列互补的序列、且具有SNP位点的DNA探针、和DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸的反应体系，就可以通过从注入孔34仅注入SNP分型测定对象的DNA试样液，进行测定对象的DNA的SNP分型。再者，作为使试样液从反应腔室42通过流路43移动至测定腔室41的手段，可以使用注射泵、柱塞泵、蠕动泵等的外部泵、一体组装在生物传感器上的微型泵、通过使生物传感器本身旋转而得到的离心力等。实施例(实施例1)以下，更具体地说明本发明的生物传感器。另外，本发明并不限于以下的实施例。以下，说明使用一种实施方式涉及的电极基板，进行试样溶液中的焦磷酸的测定的实施例。首先，在作为绝缘基板1，在厚度为188pm的聚对苯二甲酸乙二酯的片材上，通过溅射形成700埃的金薄膜。接着，通过蚀刻，如图1所示同时形成测定电极2、对电极3、参照电极4、导电性图案5、端子6，切出规定的尺寸，制得电极基板7。测定电极2的电极面积为2,0mm2。另外，在按照上述方法制得的电极基板7的参照电极4表面上，涂布氯化银糊(DB2275日本7于乂y株式会社制造)，在80°CX30分钟的条件下干燥，在参照电极4表面上形成银氯化银电极。接着，进行测定用试剂的干燥载持。在电极基板7上划分24个点(spot),滴下各试剂。表1表示在各点滴加的试剂与点位置的关系。[表1]AB<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Buffer:1M麦黄酮缓冲液(pH8.0)lfalMgCl2:10mM氯化镁3.2|ilK3Fe(CN)6:lOOmM铁氰化钾0.2plGAP:30mM甘油醛-3-磷酸0.7^1NAD+:lOmM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2^1PPase:200U/ml焦磷酸酶0.5plGAPDH:800U/ml甘油醛-3-磷酸脱氢酶0.8|ilDP:1000U/ml心肌黄酶0.2|il①第一反应试剂层35②第二反应试剂层36③第三反应试剂层37:第四反应试剂层38在真空室内，静置如此形成试剂点的电极基板7，在室温下，真空干燥30分钟。如此操作，制得焦磷酸传感器AD。这里，作为试样溶液，将OpM、50|aM和lOOpM焦磷酸水溶液20(il滴加在各自的电极基板上，进行吸液后，在30。C5分钟的条件下，进行培养，在测定电极2上施加相对于参照电极4为600mV的电位，测定此时流经测定电极2的电流值。图7显示根据各焦磷酸浓度中施加电位60秒后的电流值绘制的曲线。当然，为了作为传感器而利用，优选各自的曲线的斜率大、直线性优良。酶仅与其它试剂分离的焦磷酸传感器A(2点)，由于基线(background)高，所以未得到定量性。在与酶相同的点上滴加GAP的焦磷酸传感器B(2点)，观察到对应于焦磷酸的浓度的电流值。将GAP设计为单独点的焦磷酸传感器C(3点)，曲线的斜率变大。另外，将NAD+设计为单独点的焦磷酸传感器D(4点)，斜率更加变大，直线性也增大。(实施例2)以下，说明使用一种实施方式涉及的SNP分型传感器，进行试样溶液中的DNA的SNP分型的实施例。首先，与实施例1同样地制得焦磷酸传感器G。但是，作为外罩基板31，如图6所示，使用不仅设置有测定腔室41、而且设置有PCR腔室42、以及连接测定腔室41与PCR腔室42的流路42的外罩基板。反应试剂层的配置与实施例1的样品C(3点型)相同。关于SNP分型的模式，说明如下。作为模板，使用对照模板aDNA)(宝酒造制)，作为完全匹配引物，使用TaKaRaPCRAmplificationKit(宝酒造制)的对照引物1(5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3':序列号1)和引物3(5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3':序列号2)，作为一碱基错配引物，使用改变引物r(5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACA-3，序列号3)和引物3，进行测定(500bp扩增用)。从注入孔33，注入蒸馏水12.4^1、10XZ-Taq很Buffer2.0(il、2.5mMeachdNTPMixture1.6[1l、25吗/^1BSA0.8^d、2.5U/|ilTaKaRaZ-Taq0.2pl、以及20pmol/pl引物1和引物3各1.0|il、ljag/mlXDNAl.Opl(总量20pl)的传感器，将其作为SNP分型传感器X，将使用引物r代替引物1的传感器，作为SNP分型传感器Y。在98°C1秒、55°C1秒、72'C10秒的条件下，进行PCR反应30循环。将PCR反应结束后的溶液，从PCR空腔42通过流路42输送至测定空腔41，表2表示与实施例2同样测定后的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>如表2所示，作为引物使用了与作为模板的XDNA的碱基序列完全互补的引物1和引物3的SNP分型传感器X，通过测定空腔41中的电化学测定，检测出因PCR空腔42内发生的PCR反应的进行而生成的焦磷酸。另一方面，SNP分型传感器Y，因为引物1'的3'末端侧与作为模板的人DNA的碱基序列不互补，所以仅进行取决于以模板XDNA为模板的引物3的延伸反应，不能进行基于PCR的扩增反应，因此几乎未观察到电流。因此，通过使用SNP分型传感器X和Y，能够检测作为SNP位点的模型的一碱基错配的分型。序列号1的<223>:引物序列号2的<223>:引物序列号3的<223>:引物产业上的可利用性根据本发明，能够提供一种焦磷酸传感器，在利用引物延伸反应的方法测定焦磷酸的方法中、可简便且高灵敏度地测定焦磷酸，以及提供一种SNP分型传感器。权利要求1.一种焦磷酸传感器，其特征在于，具有绝缘性的基板；在所述绝缘性的基板上形成的至少包括测定电极和对电极的电极系，在所述基板上载持有焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、甘油醛-3-磷酸、核苷酸类、电子媒介体和缓冲液成分，所述焦磷酸酶与所述缓冲液成分分离，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶与所述缓冲液成分分离，所述甘油醛-3-磷酸与所述缓冲液成分分离，所述核苷酸类为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者它们的组合。2.如权利要求1所述的焦磷酸传感器，其特征在于所述甘油醛-3-磷酸与所述焦磷酸酶分离，所述甘油醛-3-磷酸与所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶分离。3.如权利要求2所述的焦磷酸传感器，其特征在于所述核苷酸类与所述焦磷酸酶、所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶、所述甘油醛-3-磷酸和所述缓冲液成分中的任一种分离。4.如权利要求1所述的焦磷酸传感器，其特征在于还具有第一反应试剂层和第二反应试剂层，所述第一反应试剂层含有所述缓冲液成分，所述第二反应试剂层含有所述焦磷酸酶和所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，沿所述基板的法线方向观察时，所述第一反应试剂层与所述第二反应试剂层分离。5.如权利要求1所述的焦磷酸传感器，其特征在于还具有第一反应试剂层和第二反应试剂层，所述第一反应试剂层含有所述缓冲液成分，所述第二反应试剂层含有所述焦磷酸酶和所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，沿所述基板的法线方向观察时，所述第一反应试剂层与所述第二反应试剂层叠层。6.如权利要求5所述的焦磷酸传感器，其特征在于所述第一反应试剂层和第二反应试剂层叠层形成在所述测定电极上。7.—种SNP分型传感器，其特征在于，包括绝缘性的基板；在所述绝缘性的基板上形成的至少包括测定电极和对电极的电极系；以包围所述电极系的方式设置在所述基板上的测定腔室；设置在所述基板上的反应腔室；连接所述测定腔室与所述反应腔室的流路，在所述测定腔室内载持有焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、甘油醛-3-磷酸、核苷酸类、电子媒介体和缓冲液成分，所述焦磷酸酶与所述缓冲液成分分离，所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶与所述缓冲液成分分离，所述甘油醛-3-磷酸与所述缓冲液成分分离，所述核苷酸类为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或它们的组合。8.如权利要求7所述的SNP分型传感器，其特征在于所述甘油醛-3-磷酸与所述焦磷酸酶分离，所述甘油醛-3-磷酸与所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶分离。9.如权利要求8所述的SNP分型传感器，其特征在于所述核苷酸类与所述焦磷酸酶、所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶、所述甘油醛-3-磷酸和所述缓冲液成分中的任一种分离。10.如权利要求7所述的SNP分型传感器，其特征在于在所述反应腔室中进行DNA扩增反应。11.如权利要求10所述的SNP分型传感器，其特征在于所述DNA扩增反应为PCR反应。全文摘要本发明涉及一种焦磷酸传感器，在利用引物延伸反应测定SNP分型中的焦磷酸的方法中、能够简便且高灵敏度地测定焦磷酸。上述焦磷酸传感器的特征在于，具有绝缘性的基板(1)；在其上形成的包括测定电极(2)和对电极(3)的电极系；在上述基板(1)上设置的由焦磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、甘油醛-3-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、电子媒介体、镁盐和缓冲液成分构成的多个反应试剂层，含有上述酶的反应试剂层(36)与含有上述缓冲液成分的反应试剂层(35)分离，含有甘油醛-3-磷酸的反应试剂层(37)与含有缓冲液成分的反应试剂层(35)分离。文档编号C12M1/00GK101360993SQ20078000177公开日2009年2月4日申请日期2007年1月18日优先权日2006年1月23日发明者冈弘章,行政哲男申请人:松下电器产业株式会社