专利名称：：培养间充质干细胞的方法培养间充质干细胞的方法优先权本申请要求2006年6月26日申请的美国临时专利申请No.60/805,801的优先权。背景已经从少量的供体细胞在培养物中扩增的人干细胞可以用于修复或替换损伤或缺陷的组织并具有广泛的临床应用，用于各种疾病的治疗。再生医学领域中的最新进展证明了干细胞具有独特的特性，如自我更新能力，维持未特化状态的能力以及在特定条件下分化成特化细胞的能力。作为再生医学的重要组成部分，生物反应器或细胞扩增系统在提供细胞生长和扩增的最佳化环境中起着重要作用。生物反应器给细胞提供营养物质并除去代谢产物，以及提供有助于细胞在密闭的无菌系统中生长的生理化学环境。目前可以利用多种生物反应器。最常见的两种包括平板生物反应器和中空纤维生物反应器。平板生物反应器能够使细胞在大的平面上生长，而中空纤维生物反应器能够使细胞在中空纤维的内部或外部上生长。干细胞生长和复制领域中的常规知识认为在生物反应器或其它体外细胞扩增系统中，附着细胞如间充质干细胞(MSC)由其它MSC紧密围绕时复制较快，并因此最初应当将大量的MSC装载于细胞扩增系统中。常规知识还认为用于在生物反应器中扩增的最佳MSC是在生物反应器中扩增之前已经高度纯化或已经与其它杂质细胞类型分离的那些细胞。本发明的方法教导了令人惊讶地，情况并不是这样的。附图简述图l是可以用于本发明中的生物反应器的略图。图2是比较再接种后7天具有不同水平纯度的间充质干细胞生长的图。图3是比较再接种后14天具有不同水平纯度的间充质干细胞生长的图。图4是另一张比较具有不同水平纯度的间充质干细胞生长的图。发明概述本发明涉及体外扩增间充质干细胞的方法，其包括以下步骤将含有间充质干细胞的细胞集合接种于基质上，使得低密度的间充质干细胞附着于基质上；扩增基质上附着的间充质干细胞；从基质取出扩增的间充质干细胞；并将间充质干细胞再接种于相同或不同的基质上。详述本发明涉及在细胞培养系统中接种和扩增MSC的方法。如上所述，存在多种生物反应器配置用于培养贴壁依赖性细胞如MSC，并且本发明不依赖于任何特定的配置。然而，作为一个非限制性实例是图1中所示的中空纤维生物反应器。可以用于本发明中的细胞扩增组件或生物反应器10由外壳14内包裹的一束中空纤维膜12制成。该中空纤维束统称为膜。外壳或组件14在形状上可以是圆柱状的并可以由任何类型的生物相容性聚合材料制成。用端盖或端板16,18塞住组件14的每个末端。端盖16，18可以由任何合适的材料制成，如聚碳酸酯，只要该材料与生物反应器中待培养的细胞是生物相容的。模件可以存在至少四个入口和出口。两个口流动地连接毛细管外空间(EC空间)，一个口34用于新鲜毛细管外培养基进入中空纤维周围的空间，一个口44用于用过的毛细管外培养基流出组件。两个口还流动地连接毛细管内空间(IC空间)，一个口26用于新鲜毛细管内培养基流入中空纤维的腔内以及用于引入待扩增的细胞，一个口42用于用过的毛细管内培养基流出并从生物反应器移出扩增的细胞。可以使生物反应器中待扩增的细胞流入IC空间或EC空间中。可以使用注射器将细胞装载到生物反应器中或可以从细胞分离器将细胞直接分布于IC或EC空间中。还可以从细胞输入袋或烧瓶(显示为元件5)将细胞引入生长组件或生物反应器中，所述的细胞输入袋或烧瓶可以被无菌置于生物反应器中。如上所述，认为最初接种于细胞扩增系统中的细胞数量是细胞怎样快速扩增并在细胞扩增系统如上述的系统中达到汇合的重要因素。然而，以下的实施例1显示了实际上MSC并非必须由其它MSC紧密围绕来获得最佳生长和扩增。实施例1最初以5,50,500和5000个细胞/cm'的浓度将MSC接种于烧瓶中。测量细胞倍增所花费的时间(以小时计)。如以下表l中所示，以5个细胞/cm2的初浓度细胞的平均倍增时间为约35小时。千倍以上浓度的细胞花费了约123小时来倍增。该数据表明了最初以较低密度接种的细胞比最初以较高密度接种的细胞倍增快。将较低密度定义为在底物上约1-100个细胞/cm2，包括在底物上约5-50个细胞/cm2。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表l认为在间充质细胞扩增中重要的另一个因素是最初装载或接种于细胞扩增系统中的细胞纯度。实施例2为了测试确保MSC最大扩增的理论，必须从其它杂质细胞中纯化MSC，进行了四臂实验。为了这个和其它实施例的目的，纯化程序意思是为了从含有MSC的细胞集合中除去基本上所有杂质细胞而进行的任何附加程序。细胞集合可以是来自骨髓，外周血，脐带，胚胎的细胞或含有MSC的任何其它细胞集合。未纯化的细胞意思是没有接受纯化程序的任何上述细胞。对于每一个臂，在纯化和分级分离步骤(如果进行了)后，将细胞计数。将相同数量的来自每一个臂的纯化(或未纯化)细胞涂布平板。使细胞生长直至获得大约1x106个细胞(用于该实施例目的的汇合)。将汇合定义为细胞已经扩增使得它们覆盖生长于其上的基质的整个可利用表面的状态。对于每一个臂，进行了两套实验，一套涉及每7天传代或再接种细胞一次，另一套涉及每14天传代或再接种细胞一次。当细胞达到汇合时，停止实验。在臂1中，从供体取出大约50mL骨髄吸出物，并将lmL直接涂布于25cm2T-烧瓶中(图2和3中命名为BM)。没有进行纯化或分级分离步骤。25cm2T-烧瓶的表面积近似1.6m2中空纤维生物反应器的表面积。在臂2中，使用标准ficoll梯度纯化(图2和3中命名为Ficoll)，将从臂1收集的50mL骨髓吸出物中的10mL纯化来收集单核细胞(MNC)级分(其中发现了干细胞)。将该级分涂布于25cm2T-烧瓶上。臂3涉及从在臂1中收集的剩余40mL骨髄吸出物中洗脱MSC。将MSC压实除去杂质红细胞并使用Elutra系统(可从GambroBCT,Inc.，Lakewood，CO，USA获得)洗脱(图2和3中命名为Ro40压实)。在臂4中，使臂3剩余的未涂布级分接受裂解程序以除去任何剩余的杂质红细胞(图2和3中命名为Ro40裂解)。图2和3中显示了代表性图。如可以看到的，每7天再接种一次的间充质干细胞(图2)比每14天再接种一次的细胞(图3)以更快的速率达到汇合。令人惊讶地，接受最少操纵(直接涂布含有杂质细胞的骨髄)的细胞生长最快。接受最大操纵并因此推定具有最大纯度的细胞(洗脱过的具有任何裂解的杂质红细胞的MSC)生长最慢。这些发现还表明在达到汇合之前再接种的MSC至少和收集后最初接种的MSC生长一样快。该发现可能意味着再接种过程对生物反应器中的MSC生长没有不利影响，并且再使用(再接种)最初接种细胞的相同表面似乎对细胞的生长没有不利影响。然而，也可以将细胞再接种于不同的基质上。因此理想的是不使MSC生长至汇合。在达到汇合状态之前很久就应当收集细胞。将很快达到提供足够治疗剂量MSC的足够的细胞生长，实施例3在另一个实施例中，使用如美国专利申请US11/131063中所述的标准洗脱方案，以从骨髓富集干细胞亚群，来确定与没有从杂质细胞中纯化出来的细胞相比较纯度更高的细胞怎样生长。使六个含有基本上纯化的MSC的骨髄洗脱级分生长至汇合。基本上纯化的意思是特定洗脱级分中的大部分细胞是相同的细胞类型。这些洗脱的部分在图4中显示为Fl-F6。还使用常用的Ficoll梯度纯化程序纯化了50mL骨髓样品用于比较(图4中显示为Ficoll)。40转子关闭(图4中显示为Ro40)意思是从最初50mL骨髓样品中除去血浆、血小板和红细胞后，将转子关闭并收集40mL洗脱室中剩余的所有细胞。该程序不洗脱单个的细胞级分或亚群。图4比较了单个洗脱级分中的细胞以及Ficoll纯化的细胞和使用转子关闭收集的细胞扩增至1x108个细胞的以天计的时间。如所看到的，含有基本上最高纯化细胞的级分F1-F6生长最慢，而最少纯化的细胞(转子关闭或Ro40)生长最快。这证实了以上实施例2中的发现，即，最少纯化的细胞生长最快。实施例4如上所述，认为待扩增的MSC的纯度影响细胞在培养物中的扩增多快。实施例4比较了直接接种于中空纤维生物反应器中的50mL骨髓中的未纯化MSC细胞与接种于生物反应器之前预先选择的MSC的阿尔法估算(a)，或以天数计的细胞倍增所花费的时间。直接接种的意思是将取自患者的骨髄直接置于生物反应器中而不除去任何杂质细胞如血小板和红细胞。可以除去骨头碎片和其它非细胞物质。预先选择的意思是最初将50mL骨髓涂布于T-75烧瓶上并使其中所含的MSC附着于烧瓶上并在使其再接种于中空纤维生物反应器之前生长至汇合。预先选择可确保生物反应器中待扩增的所有细胞都是纯的MSC。测试了两种类型的中空纤维膜，以商品名Desmopan(从BayerMaterialScienceAG,DE可获得)和Polyflux(聚酰胺，聚芳基醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物)(可从GambroDialysatoren,GmBH，Hechingen，DE获得)销售的0.5%热塑性聚氨基曱酸乙酯。Desmopan和Polyflux都是合成的膜。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2如从以上表2可看到的，直接接种于生物反应器中的带有骨髓中其它杂质细胞的MSC比在生物反应器中扩增之前首先纯化的MSC以更快的速率倍增(需要较少的天数来倍增)。这对于两种类型的合成膜都是如此。如以上实施例所示，为了在细胞扩增系统中获得更快的MSC扩增，不需要从其它杂质细胞中纯化出细胞。还应当经常再接种MSC并且不允许其在再接种之前达到汇合。权利要求1.体外扩增间充质干细胞的方法，包括步骤a.)将含有间充质干细胞的细胞集合接种于基质上，使得低密度的间充质干细胞附着于基质上；b.)扩增基质上附着的间充质干细胞；c.)从基质取出扩增的间充质干细胞；d.)将取出的间充质干细胞再接种于相同或不同的基质上；和e.)重复步骤b)-d)直至达到所需数量的扩增的间充质干细胞。2.权利要求l的方法，其中低密度的间充质干细胞是大约1-100个间充质干细胞/cm2。3.权利要求1的方法，其中低密度的间充质干细胞是大约5-50个间充质干细胞/cm2。4.权利要求3的方法，其中低密度的间充质干细胞进一步包括约5个间充质干细胞/cm2的密度。5.权利要求3的方法，其中低密度的间充质干细胞进一步包括大约50个间充质干细胞/cn^的密度。6.权利要求l的方法，其中再接种间充质干细胞的步骤进一步包括在达到汇合之前再接种间充质干细胞。7.权利要求l的方法，其中接种的步骤进一步包括在进行纯化程序之前接种含有间充质干细胞的细胞集合。8.权利要求1的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的骨髓细胞。9.权利要求l的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的外周血细胞。10.权利要求l的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的脐带细胞。11.权利要求l的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的胚细胞。12.权利要求l的方法，其中接种的步骤进一步包括接种于合成膜上。13.权利要求12的方法，其中合成膜是Polyflux膜。14.权利要求12的方法，其中合成膜是Desmopan膜。15.权利要求12的方法，其中接种于合成膜上的方法进一步包括接种于中空纤维中。16.体外扩增间充质干细胞的方法，包括步骤a.)将含有间充质干细胞的未纯化细胞的集合接种于基质上，使得间充质干细胞附着于基质上；和b.)扩增基质上附着的间充质干细胞。17.权利要求16的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的未纯化骨髓细胞。18.权利要求16的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的未纯化外周血细胞。19.权利要求16的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的未纯化脐带细胞。20.权利要求16的方法，其中接种的步骤进一步包括接种含有间充质干细胞的未纯化胚细胞。21.权利要求16的方法，其中接种的步骤进一步包括接种于合成膜上。22.权利要求21的方法，其中合成膜是Polyflux膜。23.权利要求21的方法，其中合成膜是Desmopan膜。24.权利要求21的方法，其中接种于合成膜上的方法进一步包括接种于中空纤维中。全文摘要本发明涉及体外扩增间充质干细胞的方法。文档编号C12N5/0775GK101356263SQ200780001348公开日2009年1月28日申请日期2007年6月26日优先权日2006年6月26日发明者G·D·安特韦勒申请人:甘布罗Bct公司