编码木脂素甲基化酶的基因的制作方法

专利名称：编码木脂素甲基化酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有将甲基转移至木脂素上的活性的酶的基因、利用该甲基化 酶使木脂素组成改变的植物等。更加具体地说，本发明涉及具有合成甲基化木 脂素活性的酶的基因，优选来自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因 及其利用。
背景技术：
胡麻属芝麻(Sesamum indicum)，是属于胡麻科(Pedaliaceae)的1年生 草本植物。据说芝麻的原产地在中非，芝麻是大约有6000年历史的最古老的栽 培油料作物，并己在世界范围内栽培。自古以来芝麻就是珍贵的食品，被认为 是健康食品的代表。特别是芝麻种子、从芝麻种子中得到的油、芝麻种子的提 取物均在被利用(例如参照《芝麻其科学和功能性》日语原名「37^(D科学 t機能性」、并木满夫编丸善planet公司(1998))。芝麻种子内含有的成分 中约50%是脂质，约20%是蛋白质。芝麻中含有的脂质的主要成分是以油酸和亚 油酸为主体的甘油三酯，并且芝麻中还含有维生素Bl、 B2、 E等。除上述成分 之外，芝麻中还含有被统称为木脂素的植物的二次代谢物(例如芝麻素和芝麻 林素等)，这些物质具有强抗氧化性(例如参照B iochemical Sy stematics and Ecology 13， 133 — 139 (198 5 ))。关于木脂素的生物合成，例如在L ignans: biosynthes is and function, Comprehensive natu ral products chemistry, 1: 640 — 713 (1 999 ); PhytochemistryRev. 2257 — 288 (20 0 3 )等中有记载。例如在Phytochemistry Rev. 2257 — 288
(2 0 0 3 )中，表示由松柏醇聚合合成的松脂醇是首次生物合成的木脂素， 并且利用松脂醇，在各植物种内经过特有的生物合成途径可合成多种木脂素。有报告指出有助于该松脂醇合成的dirigent protein存在于连翘等中(例如参 照Science 275， 362 — 366 (1997)等)。并且还报 导了连翘的松脂醇-落叶松脂素还原酶基因(例如参照J . B i o 1 . C h e m.， 271: 29473 (1996 )、日本特表2001-507931号公报等)，T h u j ap 1 i c a t a的松脂醇-落叶松脂素还原酶基因(例如参照J . B i o 1 . C h e m. ， 2 7 4: 6 1 8 ( 1 9 9 9 )等)，以及闭联异落叶松脂素脱 氢酶及其使用方法(例如参照J . Biol. C h e m. ， 2 7 6 ( 1 6 ): 1 2614 — 23 (2001)、日本特表2 002 — 512790号公报等)。 并且从L arrea tridentata中克隆至U Larreatricin氢氧化酶 基因(例如参照P roc. Nat. Acad. Sci. USA， 100: 1 0 6 4 1 ( 2 0 0 3 )等)。关于芝麻木脂素的生物合成， 一般认为是通过胡椒醇合成酶作用于松脂醇 而合成胡椒醇，接着，通过芝麻素合成酶作用于此胡椒醇而合成芝麻素。但已 证明，从芝麻中克隆到的细胞色素P450蛋白质CYP81Q1，单独由松脂醇经过胡 椒醇而合成芝麻素(国际公开公报WO2005/030944;参照图l)。近年来，不仅是木脂素，而且木脂素糖苷也正受到关注。已知上述木脂素 分子中有几种以糖苷的形式存在于植物中。例如，芝麻种子中存在芝麻素酚糖 苷(sesaminol 2 ， 一 0 — P — D —Glucopyranoside; sesaminol 2 ， 一 0 —P —D — glucopyranosyl (1 — 2) — 0 — D — Glucopymnoside 5 及 sesaminol 2 ， 一 0 — 6 — D —glucopyranosyl (1 — 2) —0 — (—D — glucopyranosyl (1 — 6)) —P—D — Glucopyranoside )); 及松月旨醇糖苷 (Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D — glucopyranosyl (1—6) —D — Glucopyranoside; Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D —glucopyranosyl ( 1 — 2 ) 一 P — D —Glucopyranoside; Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D —glucopyranosyl (l一6) — — (P_D— glucopyranosyl ( 1 — 6 ) ) 3 — D — Glucopymnoside; 及Pinoresinoldi—O — P — D —Glucopyranoside"等。 连翘中存在(+ ) —Pinoresinol— 4 ， 一 O — e — DGlucoside及(一) 一罗
汉松树脂酚一 4—0 — Glucoside。亚麻中存在Secoisolariciresinol DiGlucoside和Pinoresinol DiGlucoside等(例如参考「生药学杂志」日语 原名「生薬学雑誌」、第32巻、第194页(1 9 7 8 );T e t r a h e d r on， 14: 649 (2003 ); Phytochemistry， 58: 5 8 7 ( 2 0 0 1 )等)。芝麻中含有的松脂醇糖苷和芝麻素酚糖苷(例如参照K a t s ii z a k i ， H.等、Biosci. Biotech. Biochem. 56， 2087 一 2 0 8 8 ( 1 9 9 2 )等)，因为在水溶性区域显示强抗氧化性，所以期待其 有与脂溶性抗氧化剂(例如生育酚)不同的应用。此外，对于木脂素糖苷主张 其有如下所述作用机理，即、木脂素糖苷的具有抗氧化性的官能团酚羟基被自 身具有的糖保护，但摄入体内后在肠内细菌具有的P —葡萄糖苷酶的作用下发 生水解，生成作为葡糖苷配基部分的脂溶性木脂素。该葡糖苷配基在肠内吸收 通过血液被运送到各脏器内，防止脏器生物膜等的氧化障碍。依据这种作用机 理，期待将木脂素糖苷作为动脉硬化预防食品而应用(例如参照T. 0 s a w a:Anticarcinogenesis and radiation protection 2: p. 327， Plenum Press, Ne w Y o )。作为木脂素糖苷以外的木脂素衍生物已知有甲基化木脂素。甲基化木脂素 与木脂素糖苷相同，具有抗氧化性的官能团酚羟基受甲基保护，因此是具有甲 氧基结构的木脂素。报导了呋喃骈呋喃类的芝麻木脂素中胡椒醇的4位羟基被 甲基化的Kobusine及芝麻素酚的2，位羟基被甲基化的Sesangolin (参照P y tochemistry 47， 583 — 591 (1998);及J. Or g.Chem. 27， 3232 — 3235 (1962))(图1)。但还不明 确催化这些合成反应的酶，并且到目前为止还没有精制、分离使呋喃骈呋喃类 木脂素甲基化的酶及编码该酶的基因的报告。已知具有催化甲基转移反应这种特定功能的蛋白质，在不同的植物种中其 氨基酸序列类似(例如参照P lant Cell 14，505 — 519 (2 0 0 2 ))。 发明内容通过改变植物的二次代谢物等的生物合成途径，能够进行有用物质的生成 及/或有用植物的育种，将这种技术称为代谢工程。如果利用这种技术，能够大 量生产任意的化合物及/或抑制不需要的物质的生产。因此，鉴于上述这些物质 的有用性，使用与木脂素代谢途径相关的基因，采用基因工程合成木脂素及其 代谢物在工业上有用。但是，有关木脂素、特别是与以芝麻木脂素为代表的呋 喃骈呋喃类木脂素的生物合成相关的基因的知识，如上所述还很有限，并且仍 未发现催化甲基化呋喃骈呋喃类木脂素生成的甲基化酶，更期望得到其基因。本发明鉴于上述状况，提供如下所示的具有木脂素甲基转移活性的酶、编 码该酶的多核苷酸，含有该多核苷酸的载体，细胞，转化体等。(1) 多核苷酸，其为下述(a) (d)中任一项所述的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有具有序列号1或3的碱基序列的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有编码具有序列号2或4的氨基酸序列的蛋白质的多 核苷酸；(c) 多核苷酸，其为与具有序列号1或3的碱基序列的部分或全部互补碱 基序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交，且编码具有将甲基转移至木脂素上 的活性的蛋白质的多核苷酸；以及(d) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号 2或4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基 酸序列，且具有将甲基转移至木脂素上的活性。(2) 如上述(1)所述的多核苷酸，其编码蛋白质，所述蛋白质具有序列 号2或4的氨基酸序列，或者具有在该氨基酸序列中添加、缺失1个或多个氨 基酸及/或被其他氨基酸替换修饰的氨基酸序列，且具有将甲基转移至木脂素上 的活性。(3) 如上述(1)所述的多核苷酸，其与具有序列号1或3的碱基序列的 部分或全部互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交，且编码具有将甲 基转移至木脂素上的活性的蛋白质。(4) 如上述(1)所述的多核苷酸，其与具有序列号1或3的碱基序列的 部分或全部互补碱基序列的多核苷酸在5 x S S C、 5 0 。C的条件下进行杂交，
且编码具有将甲基转移至木脂素上的活性的蛋白质。(5) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列号1或3的碱基序列 的多核苷酸。(6) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有编码具有序列号2或4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。(7) 如上述(1) (6)中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。(8) 如上述(1) (7)中任一项所述的多核苷酸，其编码对于呋喃骈呋 喃类木脂素具有转移甲基活性的蛋白质。(9) 如上述(8)所述的多核苷酸，其编码对于松脂醇及/或胡椒醇具有转移甲基活性的蛋白质。(10) 蛋白质，其是被上述(1) (9)中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。(11) 载体，其含有上述(1) (9)中任一项所述的多核苷酸。(12) 宿主细胞，其为被上述(11)所述载体转化的宿主细胞。(13) 该蛋白质的制造方法，其特征在于，培养或繁殖权利要求12所述的 宿主细胞，从该宿主细胞中提取具有将甲基转移至木脂素上的活性的蛋白质。(14) 植物体(例如，芝麻、连翘或亚麻)或具有与该植物体相同性质的 该植物体的后代植物体、或这些植物体的组织，其中导入上述(1) (9)中 任一项所述的多核苷酸。(15) 方法，其使用上述(1) (9)中任一项所述的多核苷酸，将甲基 转移至木脂素上。(16) 该植物体或具有与该植物体相同性质的该植物体的后代植物体，其 中，将上述(1) (9)中任一项所述的多核苷酸导入植物体内，通过表达使 产生的木脂素组成改变。(17) 多核苷酸，其具有上述(1) (9)中所述的多核苷酸的片段或其 互补序列。如果利用本发明的多肽(木脂素甲基化酶)，产生的效果是例如能够在生 物(特别是植物)中人为地调节木脂素及甲基化木脂素的量。此外，通过使用 这些重组酶使木脂素甲基化，可以改变体外和体内的物性(溶解度、动物的吸
收效率等)。此外，通过利用本发明的多核苷酸，可人工生产目前为止自然界中 未鉴定的甲基化木脂素。此外，利用本发明的多肽合成的甲基化木脂素，能够 作为新型生理功能物质的初始物质或中间体有效利用。通过使用基因重组技术使本发明的木脂素甲基化酶在所期望的生物内表达，可由松脂醇人工生产单甲基化松脂醇及/或由胡椒醇人工生产Kobusine。此外，通过使用基因重组技术使本发明的木脂素甲基化酶在所期望的生物内表达， 能够制造人为控制木脂素和甲基化木脂素的量的植物及/或微生物。在生产Kobusine或甲基化松脂醇的植物中，通过抑制本发明的木脂素甲基 化酶的表达，能够使葡糖苷配基游离，使木脂素(特别是胡椒醇及/或松脂醇) 的量增加。如果使用本发明的木脂素甲基化酶，能够由松脂醇人工生产新型甲基化木 脂素单甲基化松脂醇。


图1是芝麻木脂素的结构和代谢途径图。图2-2A是通过RT — PCR的S i 0MT1及S i OMT2在芝麻 (S. indicum cv.真濑金)不同器官的基因表达分析的结果图。图2 — 2 B是通 过RT — PCR的S rOMTl在芝麻(S. radiatum)不同器官的基因表达分析 的结果图。图3—3 A是大肠杆菌内表达的S i OMTl和松脂醇的酶反应液在A280nm 处的色谱图。图3—3 B是大肠杆菌内表达的S i 0MT1和胡椒醇的酶反应液 在A280nm处的色谱图。图4一3C是大肠杆菌内表达的S i OMT2和松脂醇的酶反应液在A280nm 处的色谱图。图4 一3D是大肠杆菌内表达的S i 0MT2和胡椒醇的酶反应液 在A280nm处的色谱图。图5 —3E是大肠杆菌内表达的S r OMTl和松脂醇的酶反应液在A280nm 处的色谱图。图5—3F是大肠杆菌内表达的S rOMTl和胡椒醇的酶反应液 在A280nm处的色谱图。图6—4A是由S i 0MT1生成的甲基化松脂醇的L C—MS的色谱图。
图7—4B是由S i 0MT1生成的甲基化胡椒醇(Kobusine)的LC一M S的色谱图。图8是使用S i 0MT1基因全长探针的Genomic Southern杂交的结果。 图9 —6A是标准品咖啡酸在A280nm处的色谱图。图9 一6B是大肠杆菌内 表达的S i OMTl和咖啡酸的酶反应液在A280nm处的色谱图。图9一6C是大 肠杆菌内表达的S r OMTl和松脂醇的酶反应液在A280nm处的色谱图。图1 0 —6D是由S i 0MT1生成的甲基化咖啡酸(阿魏酸)的LC一M S的色谱图。
具体实施方式
本发明者发现了以木脂素特别是以松脂醇及/或胡椒醇为主要基质的新型 甲基化酶，同时发现该甲基化酶可使松脂醇甲基化。到目前为止虽然已鉴定出 二甲基化松脂醇桉脂素，但仍未发现单甲基化松脂醇。本发明者通过同源性检索，从包括来自芝麻种子的5000个克隆体的EST数 据库中查找芝麻甲基化酶样基因的部分序列，其结果得到2种甲基化酶样基因(下述S i 0MT1和S i OMT2)。这些S i 0 M T基因在种子内表达强烈。 采用RACE法取得这些基因的全长碱基序列，使其在大肠杆菌内表达。使得 到的重组蛋白质与芝麻素酚或松脂醇反应后，利用HPLC分析、LC一MS 分析、及TOF—MS /MS分析，测定酶活性。其结果证明S i OMTl具有 催化使胡椒醇甲基化生成Kobusine的反应的活性。并且证明S i 0 M T 1具有 催化使松脂醇甲基化生成单甲基化松脂醇的反应的活性。认为该甲基化木脂素 是松脂醇的衍生物桉脂素的中间体。通过PCR从非洲芝麻Sesamum radiatum中 克隆S i 0MT1的同源基因S r 0MT1，确认S r OMT1具有与S i OM Tl同样的甲基化活性。"木脂素"是具有C6-C3骨架的2分子phenylpropanoid化合物主要通过这 些8-8'位聚合(8-8，键)的化合物。 一般认为木脂素对植物的生物体防御机 构有用(参照P hytochemistryRev.2， 371—390(2 ， 0 0 3 ))。作为代表性的木脂素，可以为芝麻中含有的(+ ) —芝麻素、(+ ) —芝麻素
酚、(+ ) —芝麻林素、(+ ) —松脂醇、(+ ) —胡椒醇及(+) —芝麻素酚；连翘(Forsythia intermedia)中含有的(+ )—松脂醇、 (一) 一牛蒡子苷配基及(一) 一罗汉松树脂酚；甘肃瑞香(Daphne t a n g u t i c a )中含有的(一) 一松脂醇和(一) 一落叶松脂素；亚麻(L inum usitatissimum)中含有的(+ ) —闭联异落叶松脂 素等。这些木脂素有多种分子结构(参照W o od Research 90， 2 7 — 1 1 0( 2 ， 0 0 3 )等)。以(+)—松脂醇为代表的芝麻木脂素类被分 类为在范围最广的植物种中已被鉴定的呋喃骈呋喃类木脂素。作为芝麻木脂素 之一的芝麻素，具有多种生理活性作用，对胆固醇代谢、肝功能及免疫功能的 改善有效(例如参照《芝麻其科学和功能性》日语原名「^7^0科学i:効能 性」、并木满夫编；丸善planet公司(1998))。从芝麻种子或芝麻粕中分离精 制芝麻素的方法已经实用化(例如、日本特开2 0 0 1 — 1 3 9 5 7 9公报、 日本特开平l 0 — 7 6 7 6号公报等)，以芝麻素为主要成分的具有促进乙醇分 解作用的肝功能改善/增强剂已有市售(商品名「七廿S乂」(芝麻素)，总经 销三得利株式会社)。此外，有报告指出，除芝麻素之外，其它木脂素(例如 芝麻素酚、芝麻林素等)也具有生理活性(例如参照「日本农艺化学会志」日 语原名「日本農芸化学会誌」、76: 805 — 813 (2002 ))。因此，木 脂素或其衍生物作为具有各种生理活性的生理活性物质或其中间体有用。以下，对于本发明的编码具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸、被该 多核苷酸编码的蛋白质、及其利用进行详细说明。 (1)多核苷酸首先，本发明提供下述(a) (d)中任一项所述的多核苷酸。(a) 多核苷酸，其含有具有序列号1或3的碱基序列的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有序列号2 或4的氨基酸序列；(c) 多核苷酸，其为与具有序列号1或3的碱基序列的部分或全部互补碱 基序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交，且编码具有将甲基转移至木脂素上 的活性的蛋白质的多核苷酸；以及(d) 多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号 2或4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基 酸序列，且具有将甲基转移至木脂素上的活性。在本发明书中，用语"多核苷酸"可与"基因"、"核酸"或"核酸分子" 交换使用，是指核苷酸的聚合物。在本说明书中，用语"碱基序列"可与"核酸序列"或"核苷酸序列"交换使用，以脱氧核糖核苷酸(省略为A、 G、 C及T)的序列表示。本发明的多核苷酸可以RNA (例如mRNA)的形态、或DNA的形态(例如cDNA 或基因组DNA)存在，DNA可以是双链或单链，单链DNA或RNA可以是编码链(正 义链)，或者也可以是非编码链(反义链)。在本说明书中，用语"寡核苷酸"是指数个 数十个核苷酸(例如2 60 个)结合形成的寡核苷酸，可与"多核苷酸"交换使用。对于寡核苷酸，短的 称为二核苷酸(二聚体)、三核苷酸(三聚体)，长的用30mer或100mer这种发 生聚合的核苷酸的数量表示。寡核苷酸可以作为更长的多核苷酸的片段而生成， 也可以化学合成。在本说明书中，用语"部分多核苷酸"是指该多核苷酸的片段，例如是指 至少12nt (核苷酸)，优选约15nt，更优选至少约20nt，更进一步优选至少约 30nt，最优选至少约40nt长度的片段。"至少12nt长度的片段"，例如是指含 有序列号1所示的碱基序列中的12以上连续碱基的片段。参照本说明书可提供 序列号1所示的碱基序列，所以同领域技术人员能够容易地制作以序列号1为 基础的DNA片段。例如为了制作各种大小的片段可容易地使用限制内切酶切割 或超声波切割。或者可合成制作这种片段。适当的片段(寡核苷酸)，可通过A pplied Biosystems Incorporated(ABI， 850 Lincoln Center Dr. ， Foster City, CA94404) 392型Synthesizer等合成。本发明的多核苷酸，编码具有木脂素甲基化活性的多肽。这种多核苷酸， 典型的是含有具有序列号1或3的碱基序列的多核苷酸的多核苷酸，或含有编 码具有序列号2或4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。本发明的 优选多核苷酸是具有序列号1或3的碱基序列的多核苷酸、或编码具有序列号2 或4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸，只要其编码的多肽具有木脂素甲基化活性，可以为在 序列号1或3的碱基序列中缺失、插入、替换及/或添加1个或多个(例如l 30个、1 20个、1 10个、1 数个(例如6个)1 5个、1 3个、1 2个 等)碱基后的突变体。突变体可在编码区或非编码，或在这两个区突变。编码 区的突变，可生成保守性或非保守性氨基酸的缺失、插入、替换或添加。本发明的多核苷酸，是编码具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸，包 括与具有序列号l或3的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂 交的多核苷酸。可采用Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. ， Cold Sprin g Harbor Laboratory (1989)中记载的方法的公知 方法进行杂交。通常情况下，温度越高盐浓度越低，严格度就越高(杂交越难)， 能够得到同源性更高的多核苷酸。适当的杂交温度，因碱基序列、该碱基序列 的长度的不同而不同，例如将由编码6个氨基酸的18个碱基组成的DNA片段作 为探针使用时，优选5(TC以下的温度。在本说明书中，用语"严格的杂交条件"是指，在杂交溶液(含有5 0 % 甲酰胺、5 X S S C (15 0 mM N a C 1 、 15 mM枸橼酸三钠)、5 0m M磷酸钠(p H 7 . 6 )、 5 XDenhardt液、1 0 %硫酸葡聚糖、及2 0 u g / m 1变性剪切鲑精子DN A)中，4 2'C孵育一夜后，约6 5'C时在0. IX S S C中洗净过滤器。与多核苷酸的"一部分"杂交的多核苷酸，是指与参照 多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)，更优选至少约20nt，更进一步优选至少 约30nt，最优选至少约30 70nt进行杂交的多核苷酸(DNA或RNA的任一种)。本发明提供具有与序列号1或3的碱基序列至少8 0 %同一，更优选至少 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 9 8%或9 9%同一的碱基序列的多核苷酸。对于任意特定的核酸分子，其是否与例如序列号1或3所示的碱基序列至 少80%、 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 98%、或 9 9 %同一，使用公知的计算机程序(例如B estfit program (WisconsinSequenceAnalysis Packa ge， Version8 forUnix (注册商标)，Genetic sComputerGroup, University Resear chPark, 575ScienceDrive, Madison, W I5 3 7 1 1 ))可以决定。B e s t f i t是利用S m i t h和W a t e rma n的局部同源性算法(Algorithm),发现2个序列间的最良好的同源区 段(segment )(Advances inApplied Mathema tics2: 482 489 (1981 ))。使用B e s t f i t或任意的 其他序列排列程序，决定特定的序列与本发明的参照序列例如是否95%同一时， 用参照碱基序列的全长计算同一性百分率，并且设定参数允许参照序列的核苷 酸总数的5%以下的同源性的空位。在特定实施方式中，参照(QUERY)序列(本发明的序列)和对象序 列之间的同一性(也称为全体序列排列)，使用以B r u t 1 a g等的算法(C omp. App. Biosci. 6: 237 245 (1990))为基础的 FASTDB计算机程序决定。为了计算同一性百分率，DNA序列的FAS T D B排列中优选使用的参数为Matrix=Unitary、k—tu ple = 4、 Mismatch Penal ty = l、 Joining P enalty二30、 Randomization Group Leng th = 0、 Cutoff Score = l、Gap Penal ty = 5、 Gap Size Penalty = 0. 05、 Window Size = 5 0 O或对象碱基序列的长度(更短一方)。此外，本发明包括上述多核苷酸的片段或具有其互补序列的寡核苷酸。即 使在本发明的寡核苷酸不编码木脂素甲基化多肽时，同领域技术人员应容易理 解在制作本发明的多肽时，可将本发明的多核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR) 的引物使用。不编码木脂素甲基化多肽的本发明的寡核苷酸的其他用途，可以 为下述用途(1) c DNA文库中的木脂素甲基化酶基因或其对立基因或剪切 突变体的分离；(2)为了提供木脂素甲基化酶基因的正确的染色体位置，与分 裂中期染色体Spread的原位杂交(例如"F I S H ") ( V e r m a等，H u m an Chromosomes: A Manual of Basic T echniques，PergamonPress,New York(l 9 8 8 )中记载)；及(3)用于检测特定组织的木脂素甲基化酶mRNA表达 的Northern—blot分析。本发明的多核苷酸或寡核苷酸，可作为利用反义RNA作用原理的基因表达 操作用的工具使用。利用反义RNA技术，可观察到来自内源性基因的基因产物 的减少。通过导入本发明的寡核苷酸，可使具有木脂素甲基化活性的多肽的含 量降低，其结果能够控制(增加或减少)植物中的甲基化木脂素含量或含量比。 本发明的多核苷酸或寡核苷酸，可以包括非翻译区(UTR)的序列、载体序列(包 括表达载体序列)等序列。取得本发明的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可以为将含有本发明的多核苷 酸或寡核苷酸的DNA片段进行分离的各种公知的方法。例如制备与本发明的多 核苷酸的碱基序列的一部分进行特异杂交的探针，筛选基因组DNA文库或c DNA文库，能够取得本发明的多核苷酸或寡核苷酸。作为这种探针，只要是 与本发明的多核苷酸的碱基序列或其互补序列中的至少一部分进行特异杂交的 多核苷酸(寡核苷酸)即可。这种通过杂交选择的多核苷酸，可以为天然的多核苷酸(例如来自胡麻科 植物、地衣类植物等植物的多核苷酸)，也可以为来自植物以外的多核苷酸。取得本发明的多核苷酸的其他方法，可以为使用PCR的方法。该PCR扩增 方法的特征在于，包括例如利用本发明的多核苷酸的cDNA的5'侧及/或3'侧 的序列(或其互补序列)制备引物的步骤、使用这些引物将基因组DNA (或cDNA) 等作为模板进行PCR扩增的步骤。使用本发明的方法，能够大量取得含有本发 明的多核苷酸的DNA片段。作为取得本发明的多核苷酸的供给源，没有特别限定，优选含有胡椒醇或 松脂醇的生物材料。在本说明书中，用语"生物材料"是指生物学样品(从生 物体中得到的组织样品或细胞样品)。在下述实施例中虽然使用芝麻，但并不限 于此。使用本发明的多核苷酸，能够在转化体或细胞中合成具有木脂素甲基化活 性的多肽。使用本发明的多核苷酸，通过检测杂交的多核苷酸，能够容易地检 测出表达具有木脂素甲基化活性的多肽的生物。本发明的寡核苷酸，通过作为检测编码具有木脂素甲基化活性的多肽的多
核苷酸的杂交探针或用于扩增该多核苷酸的引物利用，能够容易地检测出表达 具有木脂素甲基化活性的多肽的生物或组织。并且，将上述寡核苷酸作为反义 寡核苷酸使用，能够抑制上述生物体或组织或细胞的具有木脂素甲基化活性的 多肽的表达。(2)多肽本发明还提供被上述本发明的多核苷酸编码的蛋白质(多肽)，这种多肽， 典型的是具有序列号2或4的氨基酸序列的蛋白质。在本说明书中，用语"多肽"可与"肽"或"蛋白质"交换使用。此外， 多肽的"片段"是指该多肽的部分片段。且本发明的多肽可从天然供给源中分 离，也可化学合成。本发明的多肽，包括天然精制产物、化学合成产物、以及从原核生物宿主 或真核生物宿主(例如包括细菌细胞、酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞及 哺乳动物细胞)中通过重组技术产生的产物。依靠重组产生步骤中使用的宿主， 可使本发明的多肽糖基化或非糖基化。并且，本发明的多肽在多种情况下，作 为宿主介导过程的结果，可含有起始的突变蛋氨酸残基。本发明还提供具有木脂素甲基化活性的多肽。在本说明书中，"木脂素甲基 化活性"是指使木脂素甲基化的活性，S卩、将甲基转移至木脂素上的活性。也 就是说，本说明书中的"甲基化酶"和"甲基转移酶"可交换使用。通过使作为甲基供给体的SAM和作为基质的木脂素与木脂素甲基化酶反应，将其反应生 成物进行HPLC或LC-MS分析，能够测定或确认"木脂素甲基化活性"。 一般的 甲基化酶活性测定法如公知文献所记载(公知文献Toquin， V. ， et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52， 495-509. ， Gang, D. R. ， et al. (2002) Plant Cell 14， 505-519.)。此外，本发明的多肽是具有序列号2或4的氨基酸序列的多肽的突变体， 且包括具有木脂素甲基化活性的多肽。这种突变体包括具有在序列号2或4的氨基酸序列中，缺失、替换、插入 及/或添加l个或多个(例如1 30、 1 20、 1 10、 1 数个(6个)、1 3个、 1 2个等)氨基酸(氨基酸残基)后的氨基酸序列，且具有将甲基转移至木脂
素上的活性的蛋白质。"缺失、替换、插入及/或添加"包括逆转、重复及类型 替换(例如将亲水性残基替换为其他残基，但通常不能将强亲水性残基替换为 强疏水性残基)。特别是，多肽中的"中性"氨基酸的替换， 一般来说几乎不影 响该多肽的活性。可容易地改变多肽的氨基酸序列中的数个氨基酸，而不显著影响该多肽的 结构或功能，这在该领域是公知的。并且还知道不仅是人为地改变，天然蛋 白质中也存在不会使该蛋白质的结构或功能显著改变的突变体。同领域技术人员，使用公知技术，能够容易地使多肽的氨基酸序列中1或 多个氨基酸突变。例如，根据公知的定点诱变法，能够使编码多肽的多核苷酸 的任意碱基突变。此外，设计与编码多肽的多核苷酸的任意位点对应的引物， 能够制作缺失突变体或附加突变体。进而，使用本发明书中记载的方法，可容 易地决定制作的突变体是否具有所期望的活性。优选的突变体具有保守性或非保守性氨基酸替换、缺失或添加。优选沉默 替换、添加及缺失，特别优选保守性替换。这些不会改变本发明的多肽的活性。通常认为的代表性保守性替换是，脂肪族氨基酸A 1 a 、 V a 1 、 L e u 、 及I 1 e中的1个氨基酸替换为其他的氨基酸；羟基残基S e r和Th r的交 换，酸性残基A s p和G 1 u的交换、酰胺残基A s n和G 1 n之间的替换、 碱性残基Ly s和A r g的交换、以及芳香族残基Phe、 Ty r之间的替换。如上详述，有关哪个氨基酸的突变可能是表达沉默型(即是否对功能有显 著有害效果)的进一步指导说明，在B o w i e ， J . U.等"D e c i p hering the Message in Protein Sequ ences: Tolerance to Amino Acid Sub stitutions"， Science 247:1306 — 1310 (1 9 9 0)中有记载。如上所述，这种突变多肽并不限于利用公知的突变多肽的制作方法，具有 人为地导入的突变的多肽，也可以为分离精制天然存在的多肽得到的突变多肽。本发明的多肽，可以为氨基酸形成肽键的多肽，但并不限于此，也可以为 含有多肽以外的结构的复合多肽。在本说明书中使用时，"多肽以外的结构"可 以为糖链、类异戊二烯(is叩renoid)基等，但未特定。
本发明的多肽，也可以包括附加多肽。作为附加多肽，例如可以为Hi S、My c、 F 1 a g等表位标记的多肽。本发明的多肽，可以为将编码本发明的多肽的多核苷酸导入宿主细胞，使 该多肽在细胞内表达的状态，也可以从细胞、组织等中分离精制。本发明的多肽，可以如下所述重组生成，也可以化学合成(例如参照Ho lighten, R.A.， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 8 2: 5131—5135 (1985 );美国专利第4 ， 6 3 1， 2 11号等)。本发明的多肽，能够催化木脂素(特别是松脂醇或胡椒醇)的甲基化反应。(3)本发明的多肽或多核苷酸的利用 本发明还提供通过使用本发明的多肽或多核苷酸，控制(增加或减少)生 物(优选植物)中的木脂素及甲基化木脂素的量的方法以及该经控制后的生物 (优选植物)。 (A)载体本发明提供用于生成具有木脂素甲基化活性的多肽时使用的载体。本发明 的载体可以为体外翻译时使用的载体，也可以为重组表达时使用的载体。本发明的载体，只要含有上述本发明的多核苷酸，没有特别限定。例如可 以为插入编码具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的cDNA的重组表达载体 等。重组表达载体的制作方法可以为使用质粒、噬菌体、或黏粒等的方法，没 有特别限定。载体的具体种类没有特别限定，可适当选择在宿主细胞中可表达的载体。 即根据宿主细胞的种类，为了使本发明的多核苷酸准确地表达而选择适当的 启动子序列，可以将使其和本发明的多核苷酸整合到各种质粒等中得到的载体 作为表达载体使用。本发明的表达载体，依赖于应导入的宿主的种类，含有表达控制区(例如 启动子、终止子及/或复制起点等)。细菌用表达载体的启动子，可使用通常用 的启动子(例如t r c启动子、t a c启动子、1 a c启动子等)，酵母用启动 子，例如可以为甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、PHO 5启动子等，丝状菌用启 动子，例如可以为淀粉酶(Amylase)、 t r p C等。此外，动物细胞宿主用启
动子，可以为病毒性启动子(例如SV4 0初期启动子、SV4 O后期启动子等)。植物体转化使用的重组表达载体，只要是在该植物体内可使本发明的多核 苷酸表达的载体，没有特别限定。作为这种载体，例如可以为具有在植物细胞内使多核苷酸进行结构表达的启动子(例如花椰菜花叶病毒的3 5 S启动子) 的载体，或者为具有通过外部剌激被诱导活化的启动子的载体。可根据使用限制酶及/或连接酶等的通常方法进行表达载体的制备。利用表 达载体的宿主的转化也可根据通常的方法进行。将使用上述表达载体进行转化的宿主进行培养、栽培或饲养后，根据通常 用的方法(例如过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱 法等)，可从培养物等中回收、精制目标蛋白质。表达载体，优选至少含有1个选择性标记。作为这种标记，在真核生物细 胞培养中可以为二氢叶酸还原酶基因或新霉素抗性基因，以及在E. co1 i 及其他细菌培养中可以为四环素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。使用上述选择性标记物，能够确认本发明的多核苷酸是否导入宿主细胞， 并且确认在宿主细胞中是否准确表达。或者，将本发明的多肽作为融合多肽(例 如与GFP的融合多肽)表达，可将GFP荧光作标记物使用。 (B)转化体或细胞本发明提供导入有编码具有上述木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的转 化体或细胞。在本说明书中，用语"转化体"不仅包括组织或器官，还包括生 物个体。转化体或细胞的制作方法(生产方法)没有特别限定，例如可以为将上述 重组载体导入宿主内进行转化的方法。这里使用的宿主细胞，没有特别限定， 可优选使用以往公知的各种细胞。具体来说，例如可以为大肠杆菌(E s c h erichia coli)等细菌、酵母(出芽酵母S accharomy ces cerevisiae、分裂酵母Schi zosaccharom ycespombe)、线虫(Caenorhabditis elega n s )、非洲爪蛙(Xenopus laevis)的卵母细胞等。上述宿主 细胞的适当的培养基及条件在该领域是公知的。此外，对作为转化的对象的生 物没有特别限定，可以为上述宿主细胞中例示的各种微生物、植物或动物。
本发明的转化体或细胞的特征在于，这些转化体或细胞使天然具有的木脂 素及/或甲基化木脂素的组成发生改变。本发明的转化体或细胞，优选植物或其 后代、或来自这些植物或其后代的组织，特别优选芝麻、连翘或亚麻。这种转 化体或细胞，通过使用本发明的控制甲基化木脂素含量的方法，能够使产生木 脂素的生物中的甲基化木脂素的含量增加或减少。本发明的转化体，可以为植物转化体。本实施方式的植物转化体可通过下 述方式取得，S卩将含有本发明的多核苷酸的重组载体导入被该多核苷酸编码 的多肽可表达的植物中。使用重组表达载体时，植物体转化时使用的重组表达载体，只要是在该植 物体内可使本发明的多核苷酸进行表达的载体，没有特别限定。作为这种载体， 例如可以为具有在植物细胞内可使多核苷酸进行结构表达的启动子(例如、花 椰菜花叶病毒的3 5 S启动子)的载体，或具有通过外部刺激被诱导活化的启动子的载体。本发明中作为转化的对象的植物，是指植物体整体、植物器官(例如叶、 花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、柔软组织、木质部、 维管束、栅状组织、海绵状组织等)或植物培养细胞、或各种形态的植物细胞 (例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶子切片、愈伤组织等任何物质。转化使用 的植物，没有特别限定，可以为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲植物中的任 何植物。向植物内导入基因时，使用同本领域技术人员公知的转化方法(例如农杆 菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等)。例如以农杆菌为介质的方法和直接向 植物细胞内导入的方法是公知的。使用农杆菌法时，将构建的植物用表达载体导入适当的农杆菌(例如A grobacterium tumefacie n s )内，根据叶盘法(内宫博文著、「植物基因操作手册」日语原名「植物遺伝子操作7二二7》」(1990) 27 31页、讲谈社科学技术、东京)等，使该株感染无菌培养叶片，可得到转化体。此外，可使用Na g e l等的方法(M icribiol. Lett.、 67、 325 (1990 ))。该方法首先例如将表达载体导入农杆菌内，接着利用P lantMolecular Bio logyManual (S. B. Gelvin等、Academic P ress Publishers)中所述的方法将转化的农杆菌导入植物细 胞或植物组织内。这里，"植物组织"包括培养植物细胞得到的愈伤组织。使用 农杆菌法进行转化时，可使用双元载体(binary vector) ( p B I 1 2 l或p P Z P 2 0 2等)。此外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织内的方法，已知有电穿孔 法、基因枪法。使用基因枪时，可直接使用植物体、植物器官、植物组织本身， 也可制备成切片后使用，还可以制备原生质体使用。可将上述制备的试料用基 因导入装置(例如PDS — 1 0 0 0 (B I 0 —RAD公司)等)处理。处理 条件因植物或试料的不同而不同，但通常在压力约4 5 0 2 0 0 0 p s i 、 距离约4 1 2 cm的条件下进行。已导入基因的细胞或植物组织，首先用潮霉素抗性等抗药性选择，接着利 用通常方法使植物体再生。从转化细胞到植物体的再生，可根据植物细胞的种 类采用同领域技术人员公知的方法进行。将植物培养细胞作为宿主使用时，转化是利用基因枪法、电穿孔法等将重 组载体导入培养细胞内。转化的结果得到的愈伤组织、芽、毛状根等，可直接 在细胞培养、组织培养或器官培养中使用，并且使用以往公知的植物组织培养 法，通过投入适当浓度的植物激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、 乙烯、油菜素甾醇等)等，能够使其再生为植物体。可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等来确认基因是否导入 植物内。例如从转化植物中制备DNA，设计DNA特异性引物进行PCR。一旦取得本发明的多核苷酸整合到基因组内的转化植物体，通过该植物体 的有性生殖或无性生殖可得到其后代。此外，从该植物体或其后代、或从该植 物体或其后代的克隆体中，例如得到种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、 愈伤组织、原生质体等，以这些为基础能够量产该植物体。因此，本发明包括 可表达地导入本发明的多核苷酸的植物体，或具有与该植物体相同性质的该植 物体的后代，或来自上述植物体或其后代的组织。对各种植物的转化方法已有报导，作为本发明的转化体植物，例如可以为 芝麻、稻子、烟草、大麦、小麦、油菜籽、马铃薯、番茄、白杨、香蕉、有加 利树、甘薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、蔷薇、菊花、康乃馨、 金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗、洋水仙、大丁草、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、天竺葵属植物、天竺葵、矮牵牛、蓝翅草、郁金香、连翘、拟南芥、亚 麻及百脉根等，但不限于这些。在优选实施方式中，可使用芝麻制作本发明的转化体。芝麻的转化体的制作方法，例如可以为T.Asamizu: Transformation o f sesame plants using MAT vector s ystem: introduction of fatty acid d esaturase genes. Sesame Newsletter 16: 22 25 (2002)中记载的公知方法。使用如此得到的转化芝麻，因为在该芝麻内生产甲基化木脂素，所以能够 用低成本且环境低负荷的生产工序生产甲基化木脂素(胡椒醇及/或松脂醇)。在其它优选实施方式中，本发明的转化体可优选使用烟草。烟草和矮牵牛 都是容易转化的代表性植物，由单个除去细胞壁的细胞(原生质体)可再生单 个植物个体。这种再生的单个植物个体与来自多细胞的单个个体不同，不会形 成嵌合体状，能够高效制作转化体。烟草转化的优选方法可为叶盘法。这种方法操作容易，可从1枚叶切片上 得到数个独立的转化体。转化的方法例如在"新生物化学实验指导3核酸的分 离、分析和基因试验法化学同人"日语原名「新生物化学実験O手引会3 核 酸O分離'分析t遺伝子実験法化学同人」(1 9 9 6年)中有记载。使用上述得到的转化烟草，能够用低成本且环境低负荷的生产工序生产木 脂素甲基化酶。在其他优选实施方式中，本发明的转化体可优选使用稻子。使用转化稻子， 能够用低成本且环境低负荷的生产工序在该稻子内生产木脂素甲基化酶。本发明的转化体，只要是含有木脂素(特别是松脂醇或胡椒醇)的生物， 不论是什么生物种类，只要导入上述多核苷酸就可生产该甲基化木脂素。使用导入含有编码本发明的多肽的多核苷酸的重组表达载体的转化体，能 够催化植物等生物中内在的木脂素进行甲基化的反应，所以可用低成本且环境 低负荷的生产工序大量制备甲基化木脂素。并且，本发明通过大量制备甲基化 木脂素，能够提供廉价的食品或工业制品。
使用本发明的转化体，能够在低成本且环境低负荷的条件下提供催化木脂 素甲基化反应的多肽。在一实施方式中，本发明涉及的细胞可以为各种细菌宿主。本实施方式涉 及的细胞，可通过下述方式取得，g卩将含有本发明涉及的多核苷酸的重组载 体导入被该多核苷酸编码的多肽可表达的细胞中。同领域技术人员，根据本说明书中的记载容易理解如果导入含有编码具 有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的重组表达载体，就能够对从细菌到高 等植物的广泛范围的生物赋予木脂素甲基化能力。本发明的细胞，只要是含有木脂素(特别是松脂醇或胡椒醇)的生物，不 论是什么生物种类，只要导入上述多核苷酸就可生产该甲基化木脂素。使用导入含有编码本发明的多肽的多核苷酸的重组表达载体的细胞，能够 催化该细胞内的木脂素甲基化反应，所以可用低成本且环境低负荷的生产工序 大量制备甲基化木脂素。并且本发明通过大量制备甲基化木脂素，能够提供廉 价的食品或工业制品。使用本发明的细胞，能够在低成本且环境低负荷的条件下提供催化木脂素 甲基化反应的多肽。(C)多肽的生产方法 本发明提供生产本发明的多肽的方法。使用本发明的多肽的生产方法，能 够在低成本且环境低负荷的条件下提供催化木脂素甲基化反应的多肽。此外， 使用本发明的多肽的生产方法，可容易生产催化木脂素甲基化反应的多肽。本发明的多肽的生产方法，可使用含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体。本发明的多肽的生产方法，优选将上述载体用于无细胞蛋白质合成体系。 使用无细胞蛋白质合成体系时，可使用各种市售的试剂盒。优选本实施方式的 多肽的生产方法包括孵育上述载体和无细胞蛋白质合成液的工序。本实施方式的多肽的生产方法，也可使用重组表达体系。使用重组表达体 系时，可采用下述方法等，即将本发明的多核苷酸整合到重组表达载体内后， 利用公知的方法可表达地导入宿主内，然后精制在宿主内翻译得到的上述多肽 的方法。重组表达载体，可以是质粒也可以不是质粒，只要能够将目标多核苷
酸导入宿主内即可。优选本实施方式的多肽的生产方法包括将上述载体导入宿 主内的工序。宿主可使用原核生物或真核生物，作为原核生物宿主，例如可使用属于Es c h e r i c h i a属的细菌(例如大肠杆菌(E scherichia c o 1 i )等)、例如属于B a c i 1 1 u s属的细菌(例如、Bacillus s ii b t i 1 i s )等。作为真核生物宿主，可使用低等真核生物(例如酵母 或丝状菌等真核生物微生物)。作为酵母，可以为S accharomyces 属微生物(例如Saccharomycescerevisiae等)，作 为丝状菌，可以为A s p e r g i 1 1 u s属微生物(例如A s p e r g i 1 lusoryzae、 Aspergillus niger等)、Peni c i1 i um属微生物。此外，动物细胞或植物细胞可作为宿主使用。作为 动物细胞，可以为小鼠、大鼠、猴子、人体等的细胞。并且，昆虫细胞(例如 蚕细胞、或蚕的成虫)也可作为宿主使用。上述宿主细胞没有特别限定，可优选使用以往公知的各种细胞。具体来说， 例如可以为大肠杆菌(E scherichia coli)等细菌、酵母(出 芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母S c hizosaccharomyces pombe)、线虫(Caeno rh abditis elegans)、非洲爪蛙(Xenopus laevi s )的卵母细胞等，没有特别限定。对上述宿主细胞而言合适的培养基以及条 件，为同领域内所公知。这样在宿主内导入外源多核苷酸时，关于表达载体，优选以外源多核苷酸 表达的方式整合在宿主内发挥功能的启动子。精制重组产生的多肽的方法，因 使用的宿主、多肽的性质的不同而不同，可利用标签(tag)等比较容易地精制目 标多肽。本实施方式涉及的多肽的生产方法，优选还包括从含有本发明的多肽的细 胞或组织的提取液中精制该多肽的工序。精制多肽的工序，优选利用公知的方 法(例如破坏细胞或组织后进行离心分离，回收可溶性组分的方法)，从细胞、 组织中制备细胞提取液后，通过公知的方法(例如硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸 提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用色谱法、
亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、及凝集素层析法)从该细胞提取液中精制的 工序，但并不限于此。最优选使用高效液相色谱法(HPLC)进行精制。本发明的多肽，可以从天然表达本发明的多肽的细胞或组织中精制该多肽， 也可以通过化学合成制备。制作突变多肽的方法，没有特别限定，例如可以通过使用下述方法，制作突变多肽。即位点专一诱变法(例如参照H ashimoto—Gotoh， Gene 152， 271—275 (1995 ))，利用PCR法在碱基序列中 导入点突变制作突变多肽的方法，或通过插入转座子制作突变株的方法等公知 的制作突变多肽的方法。制作突变多肽时也可利用市售的试剂盒。因此，本发明的多肽的生产方法，只要至少根据具有木脂素甲基化活性的 多肽的氨基酸序列、或编码具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的碱基序 列，使用公知的常用技术即可。 (D)甲基化木脂素生产方法到目前为止，木脂素及甲基化木脂素的生产是通过提取芝麻进行的，因此 存在无法大量生产等问题，但是，根据本发明能够低成本大量生产木脂素及甲 基化木脂素。本发明提供用表达本发明的多肽的生物体或细胞来生产甲基化木脂素的方 法。上述生物体可以是天然的未改变的生物体，也可以是使用重组表达体系的 转化体。本发明的甲基化木脂素生产方法，能够高效生产木脂素(特别是松脂 醇或胡椒醇)。在一实施方式中，本发明的甲基化木脂素生产方法的特征在于，使用用编 码本发明的多肽的多核苷酸转化的生物体或其组织，生产甲基化木脂素。优选 上述生物体是上述转化体植物或细菌，特别优选大肠杆菌、芝麻、连翘或亚麻。本发明的甲基化木脂素生产方法，包括将编码本发明的多肽的多核苷酸导 入上述生物体内的工序。将多核苷酸导入上述生物体内的工序，使用上述各种 基因导入方法即可。本实施方式在该方面，上述生物体在转化前产生的甲基化 木脂素和转化后产生的甲基化木脂素的组成不同。具体来说，从上述生物体中 得到的木脂素和甲基化木脂素的含有率增加。本实施方式该方面涉及的甲基化 木脂素生产方法，优选还包括从上述生物体中提取甲基化木脂素的工序。
本发明的甲基化木脂素生产方法，包括将本发明的寡核苷酸作为反义寡核 苷酸导入天然表达本发明的多肽的生物体内的工序。将寡核苷酸导入上述生物 体内的工序，使用上述反义RNA技术即可。本实施方式涉及的甲基化木脂素生 产方法，优选还包括下述工序，即使用上述抗体或寡核苷酸来鉴定天然表达 本发明的多肽的生物体的工序。本实施方式该方面涉及的甲基化木脂素生产方 法，优选还包括从上述生物体中提取甲基化木脂素的工序。在本实施方式中，上述生物体在导入上述寡核苷酸之前产生的甲基化木脂 素和导入后产生的甲基化木脂素的组成不同。具体来说，从上述生物体得到的 木脂素及甲基化木脂素的含有率降低。 (E)食品和工业制 品 本发明提供使用根据上述甲基化木脂素生产方法得到的甲基化木脂素制造 的食品及工业制品。本项中记载的食品，可以是上述转化植物体的种子、果实、 切穗、块茎及/或块根，也可以是使用从上述转化植物体中提取的甲基化木脂素 制造的食品(例如芝麻、连翘或亚麻、或其加工食品)。本发明涉及的食品或工 业制品，可含有期望量的木脂素(特别是松脂醇或胡椒醇)。例如，可以将从上述甲基化木脂素含量增加的本发明的转化植物中提取的 甲基化木脂素提取液，作为甲基化木脂素含量高的食品提供。此外，不仅限于 提取的甲基化木脂素，还可以将上述转化植物体的种子、果实、切穗、块茎及/ 或块根等作为含有大量甲基化木脂素的食品提供。使甲基化木脂素的组成改变 的对象没有特别限定，除植物之外，还可以将动物、细菌或酵母等所有生物作为对象。此外，根据木脂素及甲基木脂素的独特的物性，本发明的多肽或多核苷酸， 可作为工业制品(例如薄膜、生物降解性塑料、功能性纤维、润滑油、或洗剂 类工业制品)的原料使用。在本说明书中，虽然记载了芝麻的木脂素甲基化多肽的一个例子，但本发 明并不限定于来自芝麻的多肽或多核苷酸，本发明涉及具有木脂素甲基化活性 的全部多肽及其应用，这一点为同领域技术人员所知晓。木脂素甲基化酶可以 来自植物、动物或微生物中的任何生物，只要具有木脂素甲基化酶活性就能够 控制木脂素的量。并且，本发明还涉及通过导入编码木脂素甲基化酶的多核苷
酸而制作的木脂素的量得到调节的植物、其后代或它们的组织，其形态可以为 切花。使用本发明的木脂素甲基化多肽，能够促进或抑制甲基化木脂素的生成。 此外，使用通常方法，将上述多核苷酸导入植物内，使该多核苷酸结构或组织 特异性表达，使目标多肽的表达增加，以及通过使用反义法、共抑制法及RNAi 法等，能够抑制目标多肽的表达，易为同领域技术人员所理解。实施例本发明根据以下的实施例进一步详细说明，但并不限于此。实施例中使用的分子生物学的方法，只要没有另外详述，均根据国际公开WO2004/018682号公报(PCT/JP03/10500)或M olecular Cloning (Sambrook等、Cold Sp ringHarbourLaboratoryPress, 1989)中记载的方法。实施例l:芝麻种子的EST分析按照制造商推荐的方法，使用Rapid Excision试剂盒(Stratagene公司)， 将公知文献(国际公开公报W02005/030944)中记载的来自芝麻的c DNA噬 菌体文库剪切连接到pBK-CMV噬菌粒(Stratagene社)上，使感染大肠杆菌。从 含有来自该芝麻种子的E S T的大肠杆菌菌落中随机选择5000克隆体，使用M 13RV引物(序列号5)和M4 (-20)引物(序列号6)，在下述条件下进行菌 落P C R 。在含有lXEx — Taqb u f f e r ( T a k a R a )、 0 . 2 mM d N T P s 、引物各0. 2pmol/ul、 Ex — Taq polymera se 1. 2 5 U的混合液中悬浮大肠杆菌菌落，9 4'C反应5分钟后，使9 4'C1分钟，5 5'C1分钟，7 2。C2分钟的反应进行3 0个循环，P C R扩增 后，7 2"C保持7分钟。序列号5: M13RV:5， -caggaaacagcattgac 序列号6: M4-20:5， -gtaaaacgacggccagt
将这些PCR产物供给琼脂糖凝胶电泳，通过溴化乙锭染色，确认PBK —CMV中含有的E S T被特异性扩增。将这5000种PCR产物4 y 1禾CI 10皿it 的Exonucleasel (USB公司)禾口 2unit的Shrimp Alkaline phosphatase (U SB公司)混合，37。C保持30分钟，8(TC保持20分钟结束酶反应。使用该酶反应液l" 1，在下述条件下进行直接测序反应。测序反应液含有酶反应液1u 1、5xBigDyeSequencingBuf fer ver. 3. 1 ( A p p 1 ied Biosystems)3yl、 BigDyeSequencing R R ver. 3. l(Applied Biosystems) 2yl、1.6p mol/ li 1 M13RV引物lu 1 、灭菌水13y 1 。测序反应是在96。C反应1分钟后， 使96。C10秒、5(TC5秒、60。C4分钟的反应进行25个循环。测序反应液利用D y e E x 9 6 (QIAGEN公司)，根据制造商推荐的方法生成，使用S e q u e n cermodel 3100 (AppliedBiosystems公司)决定碱基序列。得到的5000种碱基序列用B last x进行同源检索，从其中鉴定出与甲 基化酶基因具有同源性的2种芝麻甲基化酶(Sesamum indicum 0—methyltransferase;以下略为SiOMT)的部分序列。Blast x分析的条件 如下所述，程序Blastx ver. 2.2.9，数据库n r ，遗传 密码standard ( 1 )，过滤器LOW complexity 、E xpect: 10， Word size: 3， Matrix: BLOSUM6 2， GapCosts: Existence11， Extension 1。实施例2:芝麻甲基化酶基因的表达分析为了分析通过ES T分析得到的二种S i 0MT1和S i OMT2基因表达 模式，对于公知文献(国际公开公报W02005/030944)记载的芝麻的不同器官 的cDNA，在以下条件下进行RT —P C R。PCR反应液含有cDNAlul、lXEx—Taq buffer (TakaRa)、 0. 2 mMdNTPs、引物各0. 2 p m o 1 / u 1 、 Ex — Taqpolymerase 1. 25U。
94 °C反应5分钟后，
使9 4 °C 1分钟、5 5 °C 1分钟、7 2 °C 2分钟的反应进行3 2个循环，P C R 扩增后，7 2。C保持5分钟。作为S i 0MT1及S i OMT2特异性引物，使 用S i OMT1-FW (序列号7 )禾卩S i OMT1-R V (序列号8 )以及S i OMT2-FW (序列号9)和S i OMT2-R V (序列号10)。为了比较S i 0 MT基因的表达量和内源性基因的表达量，同时进行作为内部标准的基因的P C R反应。具体来说，使用S i 1 8 S r RN A — F引物(序列号11)和S i 1 8 S r RN A —R引物(序列号12)，进行芝麻的1 8 Sr i b o s o m a 1RN A基因(登录号AF169853)的PC R反应。序列号7: Si0MTl-FW:5 (-ttgccccatgtcattcaagat 序列号8: Si0MTl-RV:5 ^-aaaattcagacttataacgataccaaa 序歹U号9: SiOMT2-FW:5 '-ttagaaaaactcaattcgtctaat 序列号10: Si0MT2-RV:5 '-cctacatccacgacggaatccaaa 序歹U号lh Sil8SrRNA-FW:5' -tatgcttgtctcaaagattaa 序列号12: Sil8SrRNA - RV:5' -aacatctaagggcatcacaga将PCR产物进行电泳，进行溴化乙锭染色的结果，确认两S i OMT基因 (S i 0MT1和S i OMT2)均在种子内强烈表达(图2—2A)。即可确认 两S i OMT基因表达区域和甲基化木脂素的蓄积区域一致。实施例3:芝麻甲基化酶基因的克隆因为两EST克隆未含推定ORF的5，区域，所以使用5， Rapid Amplification of cDNA End(以下称5 ' R A C E)法，扩增各S i OMT基因的5'区域。具体来说，根据制造商推荐的方 法使用G ene Racer kit(Invitroge n公司)，用以下 引物(序列号13 16)，扩增各5，区域。序列号13: GR-Si0MTl-RV:5， -ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa 序歹ij号14: Si0MTl-NEST-RV:5' -gcaaatccacttcataaaaat 序列号15: GR-Si0MT2-RV:5， -cctcgggttccgctctttctgctcccagaa 序列号16: SiOMT2-NEST-RV:5， -atcaatttgggaaattacaaa对于S i 0MT2,因为E S T克隆未含推定O RF的3'末端，所以使用 序列号17和18的引物进行3' RACE。序歹!j号1 7 : GR-SiOMT2-FW:5， -gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt 序列号1 8 : S濯T2-NEST-FW:5， -aacgtcgttctgggagcagaaaga由RAC E法得到的扩增片段的碱基序列通过引物步移法决定，得到包括 S i 0MT1和S i OMT2基因的全长开放阅读框的碱基序列信息(序列号1 和序列号19)。.S i 0MT1和S i OMT 2相互在氨基酸序列中显示29%的序列同一性， 对于序列同一性，采用默认值(default)设定，使用C 1 u s t a 1W a 1 i g n m e n t程序(MacVector ver.7.2.2(Sy manteccorporat ion))。通过B last x分析得到的S i OMT基因的全长c DNA序列(h t tp: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，检 索具有同源性的己知蛋白质。Blast x分析的条件如下所述。程序Blastxver. 2.2.9，数据库n r ，遗传密码 standard (1),过滤器LOWcomplexity, Expe ct: 10， Word size: 3， Matrix: BLOSUM62, Gap Costs: Existence 11， Extension 1。Blast x分析结果显示，S i OMT 1与Catharanthsus roseus Caffeic acid-0-methyltransferase (COMT) (AAK20170)有74%序列同一 性，S i OMT2与Rosa hybrida(AAM23004)的0rcinol-0—methyltransferase (OOMT)有5 7%的序列同一性。由此可见，两S i OMT与已知甲基化酶 之间的序列同一性都不算高。因此，不能推定得到的两S i OMT基因的功能。
即得到的两S i OMT基因就是到目前为止仍未分离的木脂素甲基化酶的可 能性非常高。实施例4:大肠杆菌表达载体的构建对于S i OMT 1 ，使用序列号20和21的引物对，将在c DNA的起始 蛋氨酸密码子(ATG)的上游具有B g 1 I I位点、在终止密码子的下游具 有S a i I位点的片段，进行PCR扩增。另一方面，对于S i OMT2，使用序列号22和23的引物对，将在c D N A的起始蛋氨酸密码子(ATG)的上游具有B amH I位点、在终止密码子 的下游具有X h o I位点的片段进行P C R扩增。P C R使用的引物如下所示。序歹!j号20: Bgl2-SiOMTl-FW:5， -aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaaga ggcttt序歹ll号2h SalI-SiOMTl-RV: 5， -attgtcgacttatgaaattccatgatccaaatatt 序歹ll号22: BamHI-SiOMT2-FW: 5， -aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt 序歹ll号23- Xho1-SiOMT2-RV: 5， -aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaaP C R反应液(2 5 n 1 )含有作为模板的芝麻种子c DNA、各引物 0.2pmol/iil、lXKODplusbuffer (TOYO BO)、 0. 2mMdNTPs、 1 mM MgS04、 1UKOD pl us polymerase 。94 。C反应5分钟后，使9 4 °C 1分钟、5 5 t:i分钟、7 2'C2分钟的反应进行3 0个循环，PCR扩增后，7 2'C保持 3分钟。将得到的各P C R产物，根据制造商推荐的方法，插入P C R4 B 1 unt—TOPOvector (Invi trogen)的多克隆位点， 得到S iOMTl/pCR4 Blunt—TOPO (称为p S P B2678)、 SiOMT2/pCR4 Blunt—TOPO (称为p S P B2679)。分析p S P B2678和p S P B2679中含有的S i OMT碱基序列，确认是 否进行了正确的PCR。将这些质粒在附加在PCR引物上的限制酶位点消化， 得到全长S i OMT，将含有该S i OMT的约l . lk b的DNA片段插入大 肠杆菌表达载体p Q E30载体(QIAGEN)的BamHI / Sa 1 I位点， 得到S iOMTl/pQE30 (称为p S P B2690)、 SiOMT2/pQE30 (称为p S P B2686)。实施例5:重组蛋白质的制备使用上述制作的大肠杆菌表达载体P S P B2690和p S P B2686，转化大 肠杆菌菌株J Ml 0 9 (TOYOBO)，在含有最终浓度为2 0 y g / m 1的 氨苄青霉素的LB培养基中于3 7t:前培养一夜。将一部分前培养液添加到含 有氨苄青霉素5 0 tx g / m 1 、酸水解酪素0 . 5 ^的M 9培养基(1 0 m 1 ) 中，振荡培养直到As。。二0. 6 1. 0。接着，在培养液中加入最终浓度为 0. 5mM的IPTG (I sopropyl—3 — D— thi oga 1 ac topyranos ide)，进一步在3 0 "C振荡培养一夜后，3 0 0 0 r p m、 4 'C离心分离1 0分钟，集菌。将菌体悬浮在1 0 m 1的缓冲液(3 0 m MTris—HC1 (pH7. 5 )、 2mM MgC12、0.5mM EDT A、 50nMAPSMF)中，然后进行超声波处理，破碎大肠杆菌，接着1 5 ， 0 0 0 rpm、 4'C离心分离1 0分钟，将得到的上清液作为粗酶液用于以下活性实施例6:芝麻木脂素甲基化酶的生成物的分析将酶反应的底物使用的芝麻木脂素溶解于少量的DMSO中，然后再溶解于70% 乙醇中，制备底物溶液(1m g /m 1 )。芝麻木脂素例如可根据公知的方法 (日本农艺化学会志6 7: 1 6 9 3 ( 1 9 9 3 ))(日语原名日本農芸化学 会誌)，从芝麻中提取和精制得到。将底物溶液l 0 U 1 、在大肠杆菌中表达的 S i O M T的上述粗酶液2 0 0 y 1及1 0 mM S—Adenosyl -L-Mathianine (SAM) 1 0 y 1在反应试管中混合，然后使其在3 0 。C反应 2小时。在反应试管内添加含有0 . 1 %三氟乙酸(T F A)的1 0 0 %乙腈(2 5 0 ii 1 )，结束酶反应。用旋涡混合器(Vortex Mixer)剧烈搅拌反应试管， 然后1 5 ， Q Q 0 r p m、 4 。C离心分离5分钟，将得到的上清液用过滤器(孔 1 1 ex — LH、 Mi 1 1 i po re)洗净， 然后使用高效液相色谱法(以下称为HPLC)分析该上清液。木脂素及其甲 基化木脂素的分析条件如下所示。使用C 一 3 0柱(野村化学C 3 0—UG—5、 4. 6 mmX 1 5 0 mm)， 进行液相色谱法(L c 一 2 0 1 0 c (岛津制作所))。流动相中，A液使用0 . 1 %T F A， B液使用含有O . 1 %TF A的9 0 %乙腈。使用A液8 0 %: B 液2 0%的混合液平衡柱子(2 O分钟)后，使用直线浓度梯度(A液8 0%: B液2 0 % —A液l 0 %: B液9 0 %)，洗脱20分钟(流速0 . 6 m 1 /分)， 进一步使用A液1 0%: B液9 0%洗脱7分钟。测定2 8 0nm处的吸收，检 测样品中含有的化合物。对于化合物的各吸收峰，使用SPD—1 OAV (岛 津制作所)测定其在l 9 0 nm 4 0 0 nm处的光谱，分析具有木脂素的2 个特征最大吸收峰(2 3 0 n m和2 8 0 n m)的物质。在该条件下，在约11. 8 分钟检测出松脂醇标准品，在约15.5分钟检测出胡椒醇标准品，在约16.8分 钟检测出芝麻素酚标准品。在S i 0MT1重组蛋白质和松脂醇的反应液中，新得到具有木脂素光谱的 保留时间为14.0分钟的吸收峰A (图3 — 3 A)。此外，在S i 0MT1重组蛋白质和胡椒醇的反应液中，新得到具有木脂素光谱的保留时间约为17.7分钟的 吸收峰B (图3 — 3 B)。在S i OMT2重组蛋白质和松脂醇或胡椒醇的反应液中，没有发现新的生 成物(图4 一3 C 3 D )。并且发现，SiOMTl和SiOMT2对芝麻素酚没有木脂素甲基化活性。接着，利用LC一MS分析，决定由S i OMT1生成的新型木脂素的分子 量(液相色谱法(LC): Waters 2795 (Waters公司)，质量分析 器QUATRO micro (Micr o公司))。用5 0 X丙酮5m 1洗净 填充有1 m 1 DIAI0N H P — 2 0树脂(三菱化学)的色谱柱，然后用1 0 m 1 水平衡。将含有由S i OMTl生成的甲基化木脂素的酶反应液装入色谱柱，用 5 m 1水洗净杂质，然后使用8 0 Q/^丙酮2 m 1进行洗脱。使用蒸发仪将洗脱 液千燥固化后，再溶解于含l %甲酸的9 0 %乙腈(1 0 0 ii 1 )中，作为L C一MS分析样品。LC条件如下所示。 使用Develosil C30—UG—3柱(野村化学3 . 0X15 0mm)，对于流动相，A液使用水，B液使用l 0 0%乙腈，C液使用1 %甲 酸，D液使用l 0 OmM乙酸铵水溶液。使用l O分钟的直线浓度梯度(A液 6 0%: B液3 0X: C液5X: D液5X—A液10X: B液8 0X: C液 5%: D液5 %)洗脱，然后使用A液1 0 %: B液8 0X: C液5X: D液 5%，洗脱5分钟(流速通常O. 2ml /分)。作为铵加合离子检测信号。在这种条件下，约8.3分钟检测出吸收峰A，约11.3分钟检测出吸收峰B (图3 5)。使用离子模型(ion mode) ES+、Cone voltage 15V 、 Collision2 eV的M S条件，在100 800(m/z， 3 0分)的范围进行MS扫描，在210 400nm(30分)的范围测定 P D A。上述条件下的LC—MS分析结果是，吸收峰A的铵加合离子分子量373 (m/ z)，吸收峰B的铵加合离子分子量371 (m/ z)。(图6—4A、图7 — 4B)。因此，鉴定这些吸收峰分别是松脂醇(铵加合离子分子量3 5 9 )的单 甲基化物，及胡椒醇(铵加合离子分子量3 7 4 )的单甲基化物。以上结果证明，S i OMTl是对芝麻木脂素松脂醇及胡椒醇具有单甲基化 活性的酶。实施例7:芝麻木脂素甲基化酶同源基因的分离为了证明在芝麻种间是否功能性及结构性地保存有具有木脂素甲基化活性 的酶基因，尝试从与栽培芝麻品种S e s amumi n d i c um在细胞遗 传学上不同的非洲芝麻(Sesamumradiatum)中，分离S i OMT1的Counterpart gene ( S r OMTl)。S. r a d i a t u m是非洲现存的芝麻植物，根据细胞遗传学分析，确 定染色体数为2 n = 6 4 ，是与栽培芝麻品种S. indicum(2n = 2 6)在遗传学上不同的系统(参考文献、并木满夫、小林贞作"芝麻的科学" 朝仓书店)(日语原名「-、o科学」)。但是，已知S. r a d i a t um种 子中也蓄积有多种木脂素(参考文献、Bedigian，D.等、Bioc hemical Systematics and Ecology 1 3: 133 — 139 (1985 ))。因此，期望S . r a d i a t u m的基因 组中含有与S. indicum的Si0MT1相对应的基因。使用S . r a d i a t u m种子的c D N A ，使用Bgl2- S i 0 M T 1-FW (序列号20及)Sall-S i 0MT1—RV (序列号21)的引物对，通过P C R尝 试S r OMTl的扩增。P C R反应液含有S . r a d i a t u m种子的c D N A 1 y 1 、 IX Ex — Taq buffer (TakaRa)、0.2mM dNTPs、引 物各0.2pmol/pl、Ex — Taq polymerase 1.2 5 U 。 9 4 。C反应5分钟后，使9 4 °C 1分钟、5 5 °C1分钟、7 2 °C 2分钟的 反应进行3 0个循环，P C R扩增后，7 2 'C保持5分钟。根据制造商推荐的 方法，将得到的约1 . 1k b的P C R产物插入pCR2—TOPO vect or(Invitroge n公司)的多克隆位点内，得到S r S i OMTl / pCR2 —TOPO (pSPB2910)。根据引物步移法，决定P S PB2910中含有的S r OMTl的碱基序列(及 氨基酸序列)(序列号3和4)。 S rOMTl与S i OMTl在氨基酸序列中有 89%的序列同一性。对于序列同一性，设定默认值(default),使用C 1 u s tal Walignment程序(Mac Vector ve r. 7. 2. 2(Symanteccorporation))。这禾中高序歹廿 同一性强有力地支持SrOMTl是SiOMTl的Counterpart gene。采用与实施例2同样的方法进行RT — PCR，确认S rOMTl的种子特 异性基因表达(图2 — 2 B)。与实施例4相同，构建S r OMTl的大肠杆菌表达载体S r O M T 1/p Q E3 0 (pSPB2911)，与实施例5同样制备重组蛋白质，与实施例6同样对 其活性及生成物进行分析。S rOMTl与S i OMTl相同，对松脂醇和胡椒醇显示甲基化活性(图 5)。此外，S i OMTl对芝麻素酚不显示甲基化活性。上述结果表明，S r OMTl是S i O M T 1的Counterpart gene，本酶基因保留在芝麻种间。实施例8: S i O M T 1的基因组Southern分析
为了搞清楚芝麻基因组内的S i 0MT1基因的拷贝数，实施基因组Southern分析。根据制造商推荐的方法，使用Nucleon Phytop ure forPlantExtractionKit (Amersham公 司)，从S. i n d i c um (真濑金品种)的叶子中提取出基因组DNA。将 提取的基因组DN A 20txg用EcoRI、Hindl11， XhoI或X b a I消化后，通过使用琼脂糖凝胶的电泳进行分离。使用0 . 2 5 M H C 1使该琼脂糖凝胶水解1 5分钟后，使用1 . 5 M N a C 1 / 0 . 5 M N a O H溶液使其变性(3 0分钟)，通过添加含1. 5M NaCl的Tris —H C 1 ( p H 7 . 5 )在变性溶液中进行中和(2 0分钟)。接着，将琼脂糖 凝胶内的基因组DNA在2 0 X S S C溶液中转印到膜上(H y b r i b o n d — N、 Amersham公司)。通过U V照射使转印到膜上的基因组D N A与膜结合， 使用含有7XSDS、 5 0%甲酰胺、5XSSC、 2 %封闭试剂、0. 1% 十二烷基肌氨钠、5 0 mM磷酸钠缓冲液(p H 7 . 0 )的杂交缓冲液(高S DS缓冲液罗氏公司)，在4 2'C下进行1小时预杂交。将p S P B 2678作为模板，分别使用序列号20(Bgl2-SiOMTl — FW)及序列号21 (Sail —SiOMTl—RV)的引物对，通过P C R制 作DIG标记的杂交探针。PCR反应液含有p SPB2678质粒l n g、 IX P C R缓冲液(TaKaRa生物公司)、2 . 5 mM DIG—dNTP mixt ure(PCR DIG labeling Mix、罗氏公司)、各引物对 0. 2pmo1、 1UrTaq polymerase (TaKaRa生物公司)。 P C R反应是9 5 °C 3 0秒、5 3 °C 3 0秒、7 2 °C 2分钟的反应进行3 0个 循环。将用S ephadex G—50柱一F i n e (Boehringer公司)精 制的PCR产物作为杂交探针使用。使该探针进行热变性后，在预杂交液中添 加1 5 u 1 ， 4 2 。C孵育一夜。杂交之后，通过高严格度的条件(使用含有0 . 2 X S S C和O . 1%S D S的溶液，6 5 °C 3 0分钟进行2次)洗净膜。根据制造商的说明书，使用 D I G标记&检测试剂盒(罗氏公司)，检测杂交信号。Southern分析的结果显示，因为在任何限制酶消化的组分中都检测出2条 以上的条带，所以与S i OMT1同源性极高的基因至少有l个以上在芝麻基因
组内被编码(图8)。进一步说，期望在芝麻基因组中存在多个与S i 0MT1 功能性重复或类似的酶基因。实施例9:芝麻木脂素甲基化酶的COMT活性测定如实施例3所示，通过数据库检索，显示S i 0MT1和S r 0MT1在已 知的蛋白质中与C OMT具有最高序列同一性。这表明芝麻甲基化酶也具有C OMT活性。讨论在实施例5和实施例7中表达的S i 0MT1和S rOMTl对咖啡酸 的甲基化活性。将0.4mg/m 1咖啡酸l 0 n 1 、大肠杆菌内表达的S i OM T的粗酶液2 0 0 u 1及1 0 mMSAM1 0 u 1在反应试管内混合后， 3 0 "C反应1小时，然后采用与实施例6同样的方法供给H P L C分析。其结果，S i OMTl和S r OMTl均在与咖啡酸的反应液中，生成与标 准品阿魏酸的保留时间一致的吸收峰C (保留时间约7. 3分钟(图9 一6A 6 C ))。在本H P L C分析条件下，咖啡酸在保留时间约为3. 9分钟时被洗脱。在与实施例6同样的条件下，进行LC一MS分析，结果发现吸收峰C为 铵加合离子分子量195 (m / z)(图l 0—6D)。因此，确认吸收峰C是咖啡 酸单(铵加合离子分子量181 (m/z))甲基化生成的阿魏酸。因此证明两种木 脂素甲基化酶均具有C 0 M T活性。如上所述，本发明的多肽和多核苷酸对甲基化木脂素的生产有用。此外， 可表达地导入了本发明的多核苷酸的转化体或细胞，在食品领域、各种工业领 域中，对生产甲基化木脂素或使用甲基化木脂素的制品极为有用。上述转化体 是植物体的情况下，能够将植物体自身作为食品使用，所以在农业领域等非常 有用。通过将本发明的多肽和多核苷酸与本发明者发现的其他酶(合成胡椒醇和 芝麻素的酶S i P 1 8 9)组合，不仅是芝麻，而且可确立特定的木脂素分子 种的生产体系，其结果能够扩大特定木脂素及甲基化木脂素的生产量。因此， 本发明可在农业、食品产业、医药品产业及其相关产业广泛利用。
权利要求
1. 多核苷酸，其为下述(a)～(d)中任一项所述的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有具有序列号1或3的碱基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有编码具有序列号2或4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；(c)多核苷酸，其为与具有序列号1或3的碱基序列的部分或全部的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交，且编码具有将甲基转移至木脂素上的活性的蛋白质的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有编码蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质具有在序列号2或4的氨基酸序列中缺失、替换、插入及/或添加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有将甲基转移至木脂素上的活性。
2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其编码蛋白质，所述蛋白质具有序列号 2或4的氨基酸序列，或者具有在该氨基酸序列中添加、缺失1个或多个氨基酸 及/或被其他氨基酸替换修饰的氨基酸序列，且具有将甲基转移至木脂素上的活 性。
3. 如权利要求1所述的多核苷酸，其与具有序列号1或3的碱基序列的部 分或全部的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交，且编码具有将甲 基转移至木脂素上的活性的蛋白质。
4. 如权利要求l所述的多核苷酸，其与具有序列号1或3的碱基序列的部 分或全部的互补碱基序列的多核苷酸在5 x S S C、 5 0 "C的条件下进行杂交， 且编码具有将甲基转移至木脂素上的活性的蛋白质。
5. 如权利要求1所述的多核苷酸，其含有具有序列号1或3的碱基序列的 多核苷酸。
6. 如权利要求l所述的多核苷酸，其含有编码具有序列号2或4的氨基酸 序列的蛋白质的多核苷酸。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。
8. 如权利要求1 7中任一项所述的多核苷酸，其编码对于呋喃骈呋喃类 木脂素具有转移甲基活性的蛋白质。
9. 如权利要求8所述的多核苷酸，其编码对于松脂醇及/或胡椒醇具有转 移甲基活性的蛋白质。
10. 蛋白质，其为被所述权利要求1 9中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
11. 载体，其含有所述权利要求1 9中任一项所述的多核苷酸。
12. 宿主细胞，其为被权利要求ll所述的载体转化的宿主细胞。
13. 该蛋白质的制造方法，其特征在于，培养或繁殖权利要求12所述的宿 主细胞，从该宿主细胞中提取具有将甲基转移至木脂素上的活性的蛋白质。
14. 植物体或具有与该植物体相同性质的该植物体的后代植物体、或这些 植物体的组织，其中导入权利要求1 9中任一项所述的多核苷酸。
15. 方法，其为使用权利要求1 9中任一项所述的多核苷酸，将甲基转移 至木脂素上的方法。
16. 该植物体或具有与该植物体相同性质的该植物体的后代植物体，其中， 将权利要求1 9中任一项所述的多核苷酸导入植物体内，通过表达使产生的木 脂素组成改变。
全文摘要
本发明涉及具有将甲基转移至木脂素上的活性的酶的基因、利用该甲基化酶使木脂素组成改变的植物等。更加具体地说，本发明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，优选来自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
文档编号C12N15/54GK101213303SQ20078000006
公开日2008年7月2日 申请日期2007年3月27日 优先权日2006年3月29日
发明者小埜荣一郎 申请人:三得利株式会社