e凝胶的影像，其显示使用Ni-MAC柱的纯化步骤的各阶段的CBS 蛋白和杂质的相对量。
[0035] 图11为概括自使用Cu-IMAC柱的放大型运行的纯化概要。
[0036] 图12为汇总表，其显示在使用Zn-IMAC柱的纯化法之后的总蛋白。
[0037] 图13为SDS page凝胶的影像，其显示使用Zn-MAC柱的纯化步骤的各阶段的CBS 蛋白和杂质的相对量。
[0038] 图14为使用多步色谱纯化步骤的纯化法的方案。
[0039] 发明详沐 本发明提供用于纯化CBS蛋白的方法，其中所述CBS蛋白为天然存在的截短变体，或其 经化学切割或基因工程改造的截短物，尤其为在重组细胞中产生的截短蛋白质CBS。具体 而言，本发明提供用于纯化CBS蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供存在至少一 种杂质的含CBS的溶液；和（b)使用金属亲和色谱（IMAC)树脂进行所述含CBS溶液的色谱 分离。在另外的具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)提供存在至少一种杂质的含 CBS的溶液；和（b)使用离子交换色谱柱和金属亲和色谱（IMAC)树脂进行所述含CBS溶液 的色谱分离。
[0040] 本发明提供的方法的某些实施方案中的具体色谱分离步骤包含离子交换色谱柱。 在一个实施方案中，所述离子交换色谱柱为阴离子交换柱，优选弱阴离子交换柱。可使用 多种类型的阴离子交换树脂，包括DEAE-葡聚糖凝胶、QAE-葡聚糖凝胶、DEAE-葡聚糖纤 维素、DEAE-纤维素和DEAE-琼脂糖凝胶-FF。根据一个实施方案，所述阴离子交换树脂为 DEAE-琼脂糖凝胶-FF。
[0041] 本发明提供的某些方法中的另一种具体的色谱分离步骤包含金属亲和色谱 (IMAC)树脂，其具有适当的pH和电导率，以便在使用选择性中间洗涤以去除较弱结合蛋白 和其它分子物质的同时，允许所述蛋白质与柱结合。在某些实施方案中，利用改变咪唑的浓 度来调节色谱法期间的分配。合适的金属亲和树脂包括荷载有二价金属离子（包括镍、铜、 钴或锌）的固定化金属亲和柱。在本发明的方法的某些实施方案中，在离子交换色谱之后 使用金属亲和色谱（IMAC)柱。在这类实施方案中，所述IMAC柱优选荷载有作为二价阳离 子的锌。在本发明方法的其它实施方案中，将IMAC柱用作初始色谱步骤。在这类实施方案 中，优选使用镍或铜二价阳离子荷载IMAC柱。
[0042] 在本发明的方法的某些实施方案中提供的用于从含CBS的溶液中纯化CBS的另外 的色谱步骤包括但不限于疏水相互作用色谱（HIC)。HIC对于去除在捕获步骤期间与靶蛋 白一起洗脱的具有相对密切相关的色谱性质的杂质而言为有用的。
[0043] 在本发明的方法的某些实施方案中提供的用于从含CBS的溶液中纯化CBS的再 进一步的色谱步骤包括但不限于陶瓷羟磷灰石树脂。"陶瓷羟磷灰石"或"CHAP"是指式 (Ca ltl(P04)6(0H)2)的不可溶的羟基化磷酸妈，其在高温下烧结成球状大孔陶瓷形式。本发明 的方法亦可与松散的或装填在柱中的羟磷灰石树脂一起使用。柱尺寸的选择可由技术人员 来确定。
[0044] 在本发明的方法中有用的色谱基质为能够结合生化化合物（优选蛋白质、核酸和 /或内毒素）的物质，其中所述生化化合物对所述色谱基质的亲和力受到周围溶液（缓冲 液）的离子组成所影响。控制所述溶液的离子组成允许以除去模式（CBS通过所述色谱基 质，至少某些污染物与所述色谱基质结合）或优选以吸附模式（CBS与所述色谱基质结合） 使用本发明的色谱物质。
[0045] 在具体的实施方案中，用于纯化的方法包括均质化宿主细胞（尤其是重组细胞以 及在某些实施方案中为产生哺乳动物优选人CBS蛋白的重组细胞）的步骤，其中所述重组 构建体编码CBS蛋白，所述CBS蛋白为天然存在的截短变体，或其经基因工程改造的截短 物，尤其为其中所述构建物已针对重组细胞表达最优化。在具体的实施方案中，所述重组细 胞为微生物细胞，尤其为细菌细胞。在某些具体的实施方案中，所述细菌细胞为大肠杆菌细 胞并且所述CBS序列已在重组表达构建体中进行工程改造，以针对在所述细胞中的表达最 优化；针对在大肠杆菌中的CBS表达最优化的所述核酸序列的具体实施方案阐述于SEQ ID NO: 4中。在所述方法中，收集细胞（例如通过离心），并任选储存于-80°C。宿主细胞的均 质化通过使用物理、化学或酶促方式或通过其组合破坏所述细胞宿主来进行。有利的是，对 于自细菌来源的纯化，均质化通过用超声处理破坏所述细菌宿主的细胞壁来进行。备选或 另外地，均质化通过暴露给诸如溶菌酶等细胞壁降解酶使宿主的细菌细胞壁失稳来进行。
[0046] 本发明的方法可进一步包含澄清的CBS匀衆，其中细胞碎片已通过过滤或离心从 所述匀浆中去除。在某些实施方案中，通过以有效的转速将匀浆离心来进行澄清。所需的 离心时间尤其取决于匀浆的体积，其可凭经验确定以获得足够紧实的沉淀。为了获得基本 上不含细胞碎片的澄清匀浆，可对所述匀浆进行离心和过滤的组合。
[0047] 本文所用的术语"重组细胞"是指已向其中引入重组表达构建体的来自任何物种 的合适细胞（包括这类细胞的子代），所述重组表达构建体能够表达这样的核酸，其编码 CBS蛋白，优选人CBS蛋白，最尤其其为天然存在的截短变体、或其经化学切割或基因工程 改造的截短物的人CBS蛋白。在具体的实施方案中，通过所述重组表达构建体编码的截短 的CBS蛋白具有如在SEQ ID NO: 3中所阐述的氨基酸序列。
[0048] 本文所用的术语"细菌细胞"是指尤其使用重组基因法产生哺乳动物（优选人） CBS蛋白的细菌，其包括所述重组细胞的子代，其中所述CBS蛋白为天然存在的截短变体， 或其经基因工程改造的截短物。
[0049] 本文所用的术语"重组表达构建体"是指这样的核酸，其具有哺乳动物（优选人） CBS蛋白的核苷酸序列，以及足以指导CBS蛋白在已向其中引入所述重组表达构建体的细 胞及其子代的培养物中合成的序列。
[0050] 如在本文中所使用，提及CBS蛋白或多肽优选包括天然存在的截短变体，或其经 化学切割或基因工程改造的截短物，或融合蛋白，或其任何同源物（变体、突变体），并且具 体为哺乳动物CBS及优选人CBS。所述CBS蛋白可包括但不限于纯化的CBS蛋白、重组产生 的CBS蛋白、可溶性CBS蛋白、不溶性CBS蛋白以及与其它蛋白质缔合的分离的CBS蛋白。 此外，"人CBS蛋白"是指来自人（人类（//〇?〇 )的CBS蛋白，优选包括天然存在的 截短变体，或其经化学切割或基因工程改造的截短物。因此，人CBS蛋白可包括纯化的、部 分纯化的、重组的、突变/修饰的以及合成的蛋白质。如在本文中以及在相关的美国专利号 8, 007, 787和7, 485, 307中所公开，所述CBS蛋白截短物有利地为可溶性CBS蛋白，其在细 菌中产生而不会产生不溶性包涵体。
[0051] 本文所用的术语"同源物"（或者变体或突变体）是用于表示这样的蛋白质或肽， 其通过对天然存在的蛋白质或肽的修饰而不同于所述天然存在的蛋白质或肽（即"原型" 或"野生型"蛋白质），但保持所述天然存在形式的基本蛋白质结构和侧链结构。这类改变 包括但不限于：在一个、少数乃至数个氨基酸侧链上的改变；在一个、少数或数个氨基酸上 的改变，包括缺失（例如所述蛋白或肽的截短形式）、插入和/或取代；在一个或少数原子 的立体化学上的改变；和/或较小的衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰 化、肉