胱硫醚β-合酶的纯化的制作方法
【专利说明】胱硫醚（3-合酶的纯化
[0001] 相关申请的夺叉引用 本申请要求保护2012年3月26日提交的美国临时申请号61/615, 629和2013年3月 14日提交的美国申请号13/830, 494的权益，其各自的公开内容通过引用并入。 发明领域
[0002] 本发明一般涉及用于纯化胱硫醚e -合酶（CBS)，尤其是其截短变体的方法。本发 明亦涉及通过所述纯化方法产生的基本上纯的CBS的组合物。
[0003] 发明背景 胱硫醚合酶（CBS)在真核生物的高半胱氨酸（Hey)代谢中起重要作用（Mudd等， 2饮，遗传病的代谢和分子基础（TheMetabolicandMolecularBasesofInherited/T/seaseO，第 8 版，第 2007-2056 页，McGraw-Hill，New York)。所述 CBS 酶催化丝氛酸和 高半胱氨酸的5' -磷酸吡哆醛（PLP ;维生素B6)_依赖性缩合以形成胱硫醚，所述胱硫醚 随后用于通过另一种PLP-依赖性酶（胱硫醚Y-裂解酶）产生半胱氨酸。在具有转硫作 用（transsulfuration)途径的哺乳动物细胞中，CBS在Hey再甲基化为甲硫氨酸或其在 半胱氨酸的生物合成中的备选用途之间占据了关键的调节位置。这两个竞争性途径之间 的相对通量大致相等，并通过胞内S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet)浓度来控制（Finkelstein 和 Martin，1984, 7；沒io/. ^6?. 259:9508-13) cAdoMet 使哺乳动物 CBS 酶激活多达 5 倍，表观解离常数为 15剛（Finkelstein 等，1975，Tfes.Commun.66: 81-87 ;Roper 等，1992，ArcA 298: 514-521 ;Kozich 等，1992，Z/應. Mutation!'.113-123) 〇
[0004] 人CBS的C端调节域由约140个氨基酸残基组成（Kery等，1998, ArcA 沒io/成355: 222-232)。该区对于人的酶的四聚体化和AdoMet激活而言为必需的（Kery 等，1998,同上）。所述C端调节区亦包含先前定义的"CBS结构域"（Bateman，1997, 沒iocAe?. 5bi. 22: 12-13)。分别跨越 SEQ ID NO: 1 的氨基酸残基 416-468 和 486-543 的 这些疏水序列（CBS 1和CBS 2)，在大范围的其它不相关的蛋白质中为保守的。尽管热诱导 CBS激活的急剧转变以及此结构域中的突变可组成性激活酶的观察结果表明这些序列在所 述C端区的自动抑制功能中起作用，但其功能仍未知（Janos ik等，2001，try 40: 10625-33 ;Shan 等，2001,及皿 #〇乂 10: 635-643 ;Miles 和 Kraus，2004,7；沿〇乂 泛￡皿279: 29871-4)。在酵母CBS的C端区中亦存在两个非常保守的CBS结构域，所述酵 母CBS与人的酶的长度几乎相同。
[0005] 在健康的正常个体中，CBS介导的从Hey到胱硫醚的转化为从甲硫氨酸（Met)代 谢成半胱氨酸（Cys)的限速中间步骤。维生素&为此过程的必需辅酶。在CBS酶中具有 某些基因突变的患者中，从Hey到胱硫醚的转化变慢或缺失，导致在酶底物（Hey)的血清浓 度上的升高以及在酶产物（胱硫醚）的血清浓度上的相应降低。升高的Hey血清水平及其 并发的向尿中的排泄的临床病况，统称为高胱氨酸尿症。
[0006] CBS缺乏为遗传性高胱氨酸尿症的最常见原因，所述高胱氨酸尿症为一种严 重的威胁生命的疾病，其导致血浆、组织和尿中严重升高的高胱氨酸水平。对于高胱氨 酸尿症的患病率的估计差异很大。通过新生儿筛查的确认和临床确认已指出范围为 1:200, 000-1:335, 000 的患病率（Mudd 等，1995,邊崔病游/f 琢分f基破（ andMolecularBasisofInheritedDiseases) ,McGraw-Hill: New York，第 1279 页）。 与CBS缺陷型高胱氨酸尿症（CBSDH)相关的主要健康问题包括：具有易染血栓形成倾向的 心血管疾病，导致未经治疗和经局部治疗的患者中的高死亡率；以进行性近视和晶状体脱 位影响视觉系统的结缔组织问题；影响骨骼的结缔组织问题，其特征为马方综合征、骨质疏 松和脊柱侧凸；以及中枢神经系统问题，其包括智力迟钝和癫痫。症状包括脱位的眼晶状 体、骨骼病症、智力迟钝以及过早的动脉硬化和血栓形成（Mudd等，2001，同上）。纯合的CBS 缺乏与大量的临床症状相关联，这些症状包括智力迟钝、骨质疏松、脊柱后侧凸、中风、心肌 梗死、晶状体异位和肺栓塞。所述疾病的心血管并发症（尤其是动脉和静脉血栓形成），为 早期死亡率的主要促因。
[0007] CBS缺乏的病理生理学无疑为复杂的，但意见一致的是，终末器官损伤的根本诱因 (instigator)为血清Hey的极度升高，所述Hey为CBS的底物，其因缺乏其经CBS催化的 与L-丝氨酸缩合形成胱硫醚而在组织和血液中积累。在Hey的血液和组织浓度上的极大 升高的毒性可因Hey本身的分子反应性和生物效应而产生，或者可因其影响大量生物过程 的代谢物（例如Hey-硫代内酯）而产生（Jakubowski等，2008，/^?你/ 22: 4071-6)。在 慢性血小板聚集中的异常、在血管参数中的改变以及内皮机能障碍均已在患有高胱氨酸尿 症的患者中描述。
[0008] 目前对于CBSDH的治疗存在三种治疗选项： 1) 在维生素^响应的患者中使用药理学剂量的维生素B6来增加CBS活性的残余活性； 2) 通过严格限制Met摄入的饮食来降低血清Hey ;和 3) 通过甜菜碱介导的将Hey转化成Met来解毒，从而降低血清Hey浓度。
[0009] 这3种疗法各自目的均为降低血清Hey浓度。对于受维生素响应的CBSDH所 累的个体的标准治疗由补充以代谢配方和呈半胱氨酸形式的Cys (其在此情况下变为条件 必需氨基酸）的Met-限制饮食组成。肉、乳制品以及富含天然蛋白质的其它食物的摄入为 禁止的。需要每日消耗不美味的含氨基酸和微量营养物的合成代谢配方，以防止继发性营 养不良。补充甜菜碱（商品名：Cystadane?，同义词：三甲基甘氨酸）亦为标准疗法，其中 甜菜碱充当用于在肝中通过甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶催化的将Hey再甲基化成Met 的甲基供体（Wilcken等，1983,况份取/. J ifet/.309: 448-53)。即便在其中提供最佳护 理和资源的医疗中心中，饮食遵从性通常亦很差，并且这种非遵从性对于高胱氨酸尿症的 威胁生命的并发症的发展具有较大牵连。
[0010] 为了使患有高胱氨酸尿症的患者享有不受限制得多的饮食（例如每日摄入限于2 g蛋白质/kg，其为容易实现的），并且具有从长远来看导致临床改善的显著降低的Hey血浆 水平，用于增加酶活性的策略为如在共同待审的美国临时专利申请系列号61/758, 138中 所阐述的治疗提供可能性。最有效的治疗策略为增加酶活性，如在对维生素B6响应的高胱 氨酸尿症患者给予R比哆醇（pyridoxone)时所证实。然而，因突变的性质所致，此策略对于 维生素B 6无响应的患者为不可能的。作为增加这些患者中的酶活性的方式的酶替代疗法 (ERT)需要外源酶，所述外源酶在本领域中不存在并因此在本领域中提出对用于以用