豆蔻酰化、异戊稀化、棕榈酰化（palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。 与天然存在的蛋白质或肽相比，同源物可具有增强、减少、改变或基本上类似的性质。同源 物可包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。
[0052] 同源物可以是自然等位基因变异或自然突变的结果。编码蛋白质的核酸的天然存 在的等位基因变体为这样的基因，其与编码这类蛋白质的基因存在于基因组中基本上相同 的基因座上，但因例如突变或重组引起的自然变异所致而具有类似但不完全相同的序列。 等位基因变体通常编码这样的蛋白质，其具有类似于与其进行比较的基因编码的蛋白质的 活性。因遗传密码的简并性所致，一类等位基因变体可编码相同的蛋白质但具有不同的核 酸序列。等位基因变体亦可包含在基因的5'或3'非翻译区（例如调控区）中的改变。等 位基因变体为本领域技术人员所熟知。
[0053] 同源物可使用本领域已知的用于产生蛋白质的技术产生，包括但不限于对分离 的天然存在的蛋白质的直接修饰、直接的蛋白质合成、或者使用例如产生随机或定向诱变 的经典或重组DNA技术对编码蛋白质的核酸序列进行修饰。CBS变体描述于美国专利号 8, 007, 787,其通过引用以其整体并入到本文中；在具体和优选的实施方案中，本文所述的 本发明的试剂和方法优选包括人CBS蛋白的天然存在的截短变体或经化学切割或基因工 程改造的截短物。根据本发明的SEQ ID NO: 3的具体截短形式包括N端缺失变体、C端缺 失变体以及N端和C端双缺失的变体。
[0054] 本文所用的"基本上纯的"是指允许蛋白在体外、离体或体内的有效使用的纯度。 对于可用于体外、离体或体内的蛋白质，优选其基本上不含可干扰或者会干扰其使用、或者 至少不希望包含在CBS蛋白（包括其同源物）中的污染物、其它蛋白质和/或化学物质。
[0055] 本文所用的CBS富化的溶液为已经历一个或多个纯化步骤的溶液。
[0056] 蛋白质的纯度可通过计算倍数纯化（即提供纯化的溶液与更少纯化的溶液或未 加工的提取物相比高多少的量度的公式）来确定。倍数纯化使用下式来计算： 最终部分的比活/未加工部分的比活。
[0057] 评价纯度的另一种量度为"比活"，其计量酶的纯度。比活可使用下式来计量：
【主权项】
1. 一种用于纯化脱硫離e-合酶（CB巧蛋白的方法，其中所述CBS蛋白为天然存在 的、经化学切割的或经基因工程改造的截短CBS蛋白，所述方法包括W下步骤： (a)提供包含一种或多种杂质的含CBS的溶液；和 化）使用离子交换色谱柱和金属亲和色谱（IMAC)树脂进行所述含CBS溶液的色谱分 离，其中因此去除杂质。
2. 权利要求1的方法，其进一步包括使用疏水相互作用色谱化1C)柱进行色谱分离的 步骤。
3. 权利要求1-2的方法，其进一步包括使用陶瓷哲磯灰石树脂进行色谱分离的步骤。
4. 权利要求1-3的方法，其中所述离子交换色谱柱为弱阴离子交换柱。
5. 权利要求4的方法，其中所述弱阴离子交换柱为DEAE-琼脂糖凝胶FF柱。
6. 权利要求1-5的方法，其中使所述金属亲和色谱（IMC)树脂荷载上二价金属阳离 子。
7. 权利要求6的方法，其中所述二价金属阳离子为镶、铜、钻或锋。
8. 权利要求7的方法，其中所述二价金属离子为锋。
9. 权利要求1-8的方法，其进一步包括用含咪挫的洗脱缓冲液将CBS从所述金属亲和 色谱（IMAC)树脂上洗脱。
10. 权利要求1-9的方法，其中所述截短的CBS蛋白具有由SEQ ID NO: 3确定的氨基 酸序列。
11. 权利要求1-10的方法，其中所述含CBS的溶液为澄清的CBS溶液。
12. 权利要求1-11的方法，其中所述CBS在重组细胞中产生。
13. 权利要求12的方法，其中所述重组细胞为细菌细胞。
14. 权利要求13的方法，其中所述含CBS的溶液通过将表达重组构建体的重组细菌细 胞均质化来获得，所述重组构建体包含编码CBS的核酸序列。
15. 权利要求14的方法，其中所述CBS核酸编码截短的CBS蛋白。
16. 权利要求15的方法，其中将所述截短的CBS蛋白截短至来自SEQ ID NO: 2的 382-532、382-550或543-550的氨基酸残基之一的末端位置。
17. 权利要求16的方法，其中所述CBS核酸序列包含SEQ ID NO: 4。
18. 权利要求12-17的方法，其中所述重组细胞为大肠杆菌细胞。
19. 权利要求16的方法，其中编码所述截短的CBS蛋白的核酸序列针对在大肠杆菌细 胞中的表达最优化。
20. -种通过权利要求1-9的方法产生的基本上纯化的CBS溶液。
21. 在药学上可接受的载体中配制的权利要求20的基本上纯化的CBS溶液。
22. -种用于产生CBS富化的溶液的方法，其中所述CBS蛋白为天然存在的、其经化学 切割或基因工程改造的截短物，所述方法包括： (a)提供包含一种或多种杂质的含CBS的溶液；和 化）使用荷载有二价金属离子的固定化金属亲和色谱（IMAC)树脂进行所述含CBS溶液 的色谱分离，其中因此去除杂质。
23. 权利要求22的方法，其中所述二价金属阳离子为镶、铜、钻或锋。
24. 权利要求23的方法，其中所述二价金属离子为锋。
25. 权利要求22-24的方法，其中所述截短的CBS蛋白具有由SEQ ID NO: 3确定的氨 基酸序列。
26. 权利要求22-25的方法，其中所述CBS溶液为澄清的CBS溶液。
27. 权利要求22-26的方法，其中所述CBS在重组细胞中产生。
28. 权利要求27的方法，其中所述重组细胞为细菌细胞。
29. 权利要求28的方法，其中所述CBS溶液通过将表达重组构建体的重组细菌细胞均 质化来获得，所述重组构建体包含编码CBS的核酸序列。
30. 权利要求29的方法，其中所述CBS编码截短的CBS蛋白。
31. 权利要求30的方法，其中将所述截短的CBS蛋白截短至来自SEQ ID NO: 2的 382-532或543-550的氨基酸残基之一的末端位置。
32. 权利要求31的方法，其中所述CBS核酸序列包含SEQ ID NO: 4。
33. 权利要求22-32的方法，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
34. 权利要求22-33的方法，其中编码所述截短的CBS蛋白的核酸序列针对在大肠杆 菌细胞中的表达最优化。
35. -种通过权利要求22-34的方法产生的CBS富化的溶液。
【专利摘要】本发明提供用于纯化胱硫醚β-合酶(CBS)蛋白、尤其是其截短的变体的色谱法以及自其制备的组合物和药物组合物。
【IPC分类】C12N9-88
【公开号】CN104540940
【申请号】CN201380027463
【发明人】G. 卡里洛 R., P. 克劳斯 J., 马坦 T., 纳维 D.
【申请人】科罗拉多州大学评议会
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年3月25日
【公告号】CA2867719A1, EP2831229A1, US20130251700, WO2013148580A1