代谢途径产物的生成方法
【技术领域】 [0001] 和发明背景
[0002] 本发明在其一些实施方案中，涉及生成代谢途径产物例如虾青素的生物技术方 法。
[0003] 细菌中的天然蛋白质丰度跨5个数量级。蛋白质表达水平的平衡处于天然生物系 统正常运行的核心并且往往对于代谢工程成果至关重要。虽然对细胞内蛋白质水平的操 纵，例如强烈的过表达和低表达，广泛用于阐明生物系统的功能，但是平行微调许多基因的 水平的能力则是主要突出的挑战。与天然生物系统相反，选择在进化期间平衡蛋白质水平 时，合成系统的表达可导致蛋白质浓度不平衡。因此，合成途径在首次引入时很少发挥最佳 作用并且必须微调酶水平。
[0004] 图15A基于两步代谢途径模型示意性描绘了与酶浓度不平衡相关的主要挑战。首 先，酶低表达可限制途径流量并因此限制产物合成速率（蓝色区域）。另一个极端，过度表 达可能引起蛋白质负担，导致限制生长的细胞资源耗尽（紫色区域）。最后，酶生成和消耗 中间代谢产物之间的不平衡可导致代谢瓶颈和高浓度的潜在毒性途径中间产物（绿色区 域）。
[0005] 控制细胞内蛋白质丰度的方法包括改变启动子K. Hammer, I. Mi jakovic, P. R. Jensen, Synthetic promoter libraries - tuning of gene expression, Trends inBiotechnology 24, 53-55 (2006)]或核糖体结合位点（RBS) [H. M. Salis, E. A. Mirsky, C. A.Voigt,Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression, Nat Biotechnol 27,946-950(2009) ；H. H. Wang 等，Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution, Nature 460, 894-898(2009)]序列，调节转录产物的稳定性和改变成熟蛋白质的降解速率。
[0006] 类胡萝卜素，例如虾青素为天然色素，是造成活体中所见黄色、橙色和红色的原 因。类胡萝卜素在自然界中广泛分布并且在不同生命系统中，具有两种主要生物功能：它们 在光合作用中用作捕光色素，并且它们防御光氧化损伤。
[0007] 虾青素是最昂贵的商业用类胡萝卜素化合物（现今的市场价值高于3, 500$/kg)。 其主要在各种水生动物中用作提供色素沉着的营养补充剂。在远东，还用于饲养家禽以引 起鸡的典型色素沉着。对于食品行业也是可取且有效的无毒色素并且在化妆品中有价值。 最近，报道称虾青素是人类中的有效抗氧化剂并且因此是可取的食品添加剂。
[0008] 虽然虾青素在各种细菌、真菌和藻类中合成，但是对生物系统用于其生成的关键 限制是其产量低。低产量的其中一个原因是虾青素途径复杂，由此为了有效表达，必须在细 胞中表达所述途径的7个基因。微调这些基因中每一个的表达量对于优化虾青素表达是不 可缺少的。
[0009] Lemuth 等，[Microbial Cell Factories 10, 29, 2011]教导了奸青素在大肠杆菌 (E. coli)中的表达。
[0010] Salis 等，Nature Biotechnology，2009 年第 27 卷 No. 10,第 946-950 页，教导了 核糖体结合位点的序列。
[0011] 美国专利申请No. 20120015849教导了创建包括人工启动子库和/或经修饰核糖 体结合位点库的DNA文库和用所述文库转化细菌宿主细胞以获得对于目标染色体基因而 言有一系列表达水平的一群细菌克隆的方法。
【发明内容】
[0012] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚 核苷酸序列，其包含：
[0013] (i)编码八氢番茄红素脱氢酶（crtl)的多聚核苷酸和第一转录调控序列；
[0014] (ii)编码0-番茄红素环化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列；
[0015] (iii)编码0-胡萝卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且
[0016] 其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高 于所述crtl的表达水平。
[0017] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了包含多于2mg/g细胞干重的虾青素的 细菌细胞。
[0018] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了包含多于5mg/g细胞干重的虾青素的 细菌细胞。
[0019] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种生成虾青素的方法，包括表达编 码虾青素途径的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
[0020] (i)编码八氢番茄红素脱氢酶（crtl)的多聚核苷酸和第一转录调控序列；
[0021] (ii)编码0 -番茄红素环化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列；
[0022] (iii)编码0 -胡萝卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且
[0023] 其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高 于所述crtl的表达水平。
[0024] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种生成虾青素的方法，包括表达编 码虾青素途径的酶的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含：
[0025] (i)编码异戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第一转录调控序列；
[0026] (ii)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第二转录调控 序列；
[0027] (iii)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第三转录调控 序列；
[0028] (iv)编码八氢番茄红素脱氢酶（crtl)的多聚核苷酸和第四转录调控序列；
[0029] (V)编码0-番茄红素环化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第五转录调控序列；
[0030] (Vi)编码0-胡萝卜素酮化酶（crtw)的多聚核苷酸和第六转录调控序列；和
[0031] (vii)编码P_胡萝卜素羟化酶（crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列，
[0032] 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高 于所述crtl的表达水平。
[0033] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚 核苷酸序列，其包含：
[0034] (i)编码异戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第一转录调控序列；
[0035] (ii)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第二转录调控 序列；
[0036] (iii)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第三转录调控 序列；
[0037] (iv)编码八氢番茄红素脱氢酶（crtl)的多聚核苷酸和第四转录调控序列；
[0038] (V)编码0 -番茄红素环化酶（lcy-B)的多聚核苷酸和第五转录调控序列；
[0039] (vi)编码0 -胡萝卜素酮化酶（crtW)的多聚核苷酸和第六转录调控序列；和
[0040] (Vii)编码0 -胡萝卜素羟化酶（crtz)的多聚核苷酸和第七转录调控序列，
[0041] 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高 于所述crtl的表达水平。
[0042] 根据本发明的一些实施方案，所述多种分离多聚核苷酸序列进一步包含以下至少 一种：
[0043] (iv)编码异戊烯焦磷酸（idi)的多聚核苷酸和第四转录调控序列；或
[0044] (v)编码牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶（crtE)的多聚核苷酸和第五转录调控 序列；或
[0045] (vi)编码前八氢番茄红素焦磷酸合成酶（crtB)的多聚核苷酸和第六转录调控序 列；或
[0046] (vii)编码0 -胡萝卜素羟化酶（crtZ)的多聚核苷酸和第七转录调控序列。
[0047] 根据本发明的一些实施方案，所述第一调控序列、所述第二调控序列和所述第三 调控序列的每一个均为核糖体结合位点（RBS)。
[0048] 根据本发明一些实施方案的一方面，第一调控序列、第二调控序列和第三调控序 列的每一个均为启动子。
[0049] 根据本发明的一些实施方案，选择第一调控序列、第二调控序列和第三调控序列， 以致所述lcy-B和所述crtW的表达比所述crtl的表达水平高至少10倍。
[0050] 根据本发明的一些实施方案，选择（i)的RBS序列，以致使所述crtl的表达达到 具有如SEQ ID N0:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0051] 其中选择（ii)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQ ID N0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0052] 其中选择（iii)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQ ID N0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度。
[0053] 根据本发明的一些实施方案，选择（iv)的RBS序列，以致使所述crtl的表达达到 具有如SEQ ID N0:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0054] 其中选择（v)的RBS序列，以致使所述lcy-B的表达达到具有如SEQIDN0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0055] 其中选择（vi)的RBS序列，以致使所述crtW的表达达到具有如SEQIDN0:2或 3中所列序列的RBS至少80%的程度。
[0056] 根据本发明的一些实施方案，选择（i)的RBS序列，以致使所述idi的表达达到具 有如SEQ ID N0:5中所列序列的RBS至少80%的程度；
[0057] 其中选择（ii)的RBS序列，以致使所述crtE的表达达到具有如SEQIDN0:5中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0058] 其中选择（iii)的RBS序列，以致使所述crtB的表达达到具有如SEQIDN0:3中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0059] 其中选择（iv)的RBS序列，以致使所述crtl的表达达到具有如SEQ ID N0:7中 所列序列的RBS至少80 %的程度；
[0060] 其中选择（v)的