法和实例仅为说明性而非旨在为必要限制性。
【附图说明】
[0134] 本文仅以举例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参 考附图，强调所示细节是举例而言并且是为了说明性讨论本发明的实施方案。在这点上，连 同附图一起所做的描述使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域中的技术人员显而 易见。
[0135] 图中：
[0136] 图1说明了多基因构建体组合装配的模块化克隆策略。研发了通过直接选择正确 装配的构建体消除假阳性克隆的方法。每个目标基因与侧面为Nhel( 'N'）和Pcil( 'P'） 限制位点的氯霉素（chloramphenicol) (Cm)抗性盒接合。指定用于装配的序列含有上游 Spel( 'S'）限制位点。为将第一靶序列装配到载体中，先用Spel和Pcil消化DNA，接着进 行连接和转化。将细胞接种于补充了 Cm的选择性琼脂上。因为骨架载体不包括Cm抗性， 所以只有恰当装配（即含有指定序列和抗性标记）的克隆将能够形成菌落。为并入下一靶 序列，从细胞中提取出装配产物并用Nhel和Pcil消化，从构建体有效地去除了抗性标记。 与第一靶序列一样，使用Spel和Pcil消化第二靶序列并装配到载体中。重要的是，Nhel和 Spel限制位点的黏性末端相容并且连接在一起形成瘢痕，Nhel或Spel ( 'X'）不可裂解的 序列。第二轮装配后，如今新的构建体含有靶序列和Cm抗性，使得能够再次直接选择阳性 构建体。可以重复这一系列的事件以装配多基因操纵子。
[0137] 图2说明了靶0RF的RBS调节。所需编码序列与抗性盒配对，然后装配到在插入 位点上游含有RBS的载体上。条码和非条码装配依赖于相同基因座，但是由于技术原因在 限制位点上不同。
[0138] 图3说明了 pNiv骨架质粒。RRNB终止子位于多克隆位点上游，以将整个装配过程 中的泄露表达减到最少。
[0139] 图4为隔离RBS单元设计的示意图。已经示出了侧翼序列的组成以影响指定RBS 的表达水平。为了将这种次级效应减到最低，在RBS序列的上游和下游引物恒定间隔区和 标签序列。
[0140] 图5说明了 pSB4K5:Ptac_表达质粒。杂合Ptac启动子位于pSB4K5质粒骨架上， 在多克隆位点上游。
[0141] 图6A-D为说明使用不同荧光蛋白和诱导条件对RBS组的流式细胞术荧光测量的 图表。
[0142] 图7为比较预测RBS活性与实验荧光测量的图表。CFP(蓝色）、YFP(绿色）和 mCherry(红色）报告基因各自与RBS序列（A-F，如字母所示）配对。x-轴表示每个序列的 预测RBS活性，而y-轴表示测量的荧光水平。荧光水平经标准化，所以预测动态范围的中 点_(预测-预测^、/2)_与实验测量的每个报告基因的动态范围中点_(测量-测量 最小/2)相对应。
[0143] 图8说明了单管组合装配。在装配反应中使用pNiv:RBS质粒与6种不同RBS序 列的等摩尔混合物。使靶编码序列与质粒混合物连接以产生6种不同产物，全部含有相同 编码序列，但是位于其上游的RBS不同。
[0144] 图9说明了 RBS调节基因的合成操纵子的装配。
[0145] 图10说明了具有条码RBS位点的合成操纵子的装配。在每个装配步骤，与新装配 的RBS调节编码序列相对应的条码堆叠在操纵子的3'末端。
[0146] 图11说明了条码RBS混合物的单管组合装配。目标插入片段与pRBS-条码混合 物连接，所得文库含有在其上游具有不同RBS序列的靶编码序列。
[0147] 图12为三色报告基因操纵子-质粒图谱。
[0148] 图13为说明了操纵子中第二基因（mCherry)对第一基因（YFP)的依赖性的图表。 用颜色指示了控制mCherry的RBS序列（蓝色为RBS A，红色为RBS C，而绿色为RBS E)，并 且控制YFP的RBS序列对应于形状（星号为RBS A，圆形为RBS B，三角形为RBS C，矩形为 RBS D，十字形为RBS E，而星形为RBS F)。翻译偶联的作用显而易见，其中YFP的表达水平 调节mCherry的表达。YFP和mCherry水平之间的依赖性对数等分向量上遵循线性趋势，斜 率为?1/3。
[0149] 图14为类胡萝卜素生物合成操纵子-质粒图谱。
[0150] 图15A-D说明对于平衡的途径功能，需要调节酶表达水平。（A)使用基于可逆 Michaelis -Menten动力学，由两种酶组成的简单量化模型描绘了酶表达不平衡的结果。只 有以白色示出的酶浓度区间的一个小区域持续最优生成。（B) -小组的RBS序列跨蛋白质 表达的7个数量级。采用6个预先表征的RBS序列并且与诱导型启动子下游的目标基因配 对。
【主权项】
1. 编码邮青素途径的酶的多种分离多聚核巧酸序列，其包含： (i) 编码八氨番茄红素脱氨酶（cdl)的多聚核巧酸和第一转录调控序列； (ii) 编码目-番茄红素环化酶（Icy-B)的多聚核巧酸和第二转录调控序列； (iii) 编码目-胡萝h素丽化酶（cdW)的多聚核巧酸和第H转录调控序列；并且 其中选择所述第一、第二和第H调控序列，使得所述Icy-B和所述crtW的表达高于所 述crti的表达水平。
2. 根据权利要求1所述的多种分离多聚核巧酸序列，其进一步包含W下至少一种： (iv) 编码异戊帰焦磯酸（idi)的多聚核巧酸和第四转录调控序列；或 (V)编码巧牛儿基巧牛儿基焦磯酸合成酶（cd巧的多聚核巧酸和第五转录调控序列； 或 (Vi)编码前八氨番茄红素焦磯酸合成酶（cdB)的多聚核巧酸和第六转录调控序列； 或 (vii)编码目-胡萝h素轻化酶（cd幻的多聚核巧酸和第走转录调控序列。
3. 编码邮青素途径的酶的多种分离多聚核巧酸序列，其包含： (i) 编码异戊帰焦磯酸（idi)的多聚核巧酸和第一转录调控序列； (ii) 编码巧牛儿基巧牛儿基焦磯酸合成酶（cd巧的多聚核巧酸和第二转录调控序 列； (iii) 编码前八氨番茄红素焦磯酸合成酶（cdB)的多聚核巧酸和第H转录调控序列； (iv) 编码八氨番茄红素脱氨酶（cdl)的多聚核巧酸和第四转录调控序列； (V)编码目-番茄红素环化酶（Icy-B)的多聚核巧酸和第五转录调控序列； (Vi)编码目-胡萝h素丽化酶（cdW)的多聚核巧酸和第六转录调控序列；和 (vii)编码目-胡萝h素轻化酶（cd幻的多聚核巧酸和第走转录调控序列， 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，使得所述Icy-B和所述crtW的表达高于所 述crtI的表达水平。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的多种多聚核巧酸序列，其中所述第一调控序列、 所述第二调控序列和所述第H调控序列的每一个均为核糖体结合位点（RB巧。
5. 根据权利要求1-3中任一项所述的多种多聚核巧酸序列，其中所述第一调控序列、 所述第二调控序列和所述第H调控序列的每一个均为启动子。
6. 根据权利要求1或3所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择所述第一调控序列、所述 第二调控序列和所述第H调控序列，使得所述Icy-B和所述crtW的表达比所述crti的表 达水平高至少10倍。
7. 根据权利要求1所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择（i)的RBS序列，W致使所述 crti的表达达到具有SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（ii)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID NO:2或3中所 列序列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（iii)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID NO:2或3中所 列序列的RBS至少80%的程度。
8. 根据权利要求3所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择（iv)的RBS序列，W致使所 述crti的表达达到具有SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（V)的RBS序列，w致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID N0:2或3中所 列序列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（Vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID NO:2或3中所 列序列的RBS至少80%的程度。
9. 根据权利要求3所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择（i)的RBS序列，W致使所述 idi的表达达到具有SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（ii)的RBS序列，W致使所述crtE的表达达到具有SEQ ID NO:5中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（111)的1?5序列，^致使所述(31'巧的表达达到具有569 10^:3中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（iv)的RBS序列，W致使所述crti的表达达到具有SEQ ID NO:7中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（V)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID NO:2中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（Vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID NO:3中所列序 列的RBS至少80 %的程度；并且 其中选择（vii)的RBS序列，W致使所述crtZ的表达达到具有SEQ ID NO:6中所列序 列的RBS至少80 %的程度。
10. 根据权利要求3所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择（i)的RBS序列，W致使所 述idi的表达达到具有SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（ii)的RBS序列，W致使所述crtE的表达达到具有SEQ ID N0:3中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（111)的1?5序列，^致使所述(31'巧的表达达到具有569 10^:7中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（iv)的RBS序列，W致使所述crti的表达达到具有SEQ ID N0:5中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（V)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID N0:2中所列序 列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（Vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID N0:2中所列序 列的RBS至少80 %的程度；并且 其中选择（乂11)的1?5序列，^致使所述(3的2的表达达到具有569 10^:2中所列序 列的RBS至少80 %的程度。
11. 根据权利要求1、2或3中任一项所述的多种多聚核巧酸序列，其进一步包含： (viii)编码脱氧木丽糖-5-磯酸合成酶值XS)的多聚核巧酸和第八转录调控序列。
12. 根据权利要求11所述的多种多聚核巧酸序列，其中选择第八转录调控序列，W致 使所述DXS的