表达达到具有SEQ ID N0:6中所列序列的RBS至少80%的程度。
13. 根据权利要求1、2或3中任一项所述的多种多聚核巧酸序列，其包含在单个表达载 体中。
14. 根据权利要求1、2或3中任一项所述的多种多聚核巧酸序列，其包含在多个表达载 体中。
15. 根据权利要求4所述的多种多聚核巧酸序列，其中所述每个RBS侧面为间隔序列。
16. 根据权利要求15所述的多种多聚核巧酸序列，其中在所述每个RBS上游的所述间 隔序列与SEQ ID N0:8中所列序列至少80%同源。
17. 根据权利要求15或16所述的多种多聚核巧酸序列，其中在所述每个RBS上游的所 述间隔区与SEQ ID NO:9中所列序列至少80%同源。
18. -种细菌细胞，其包含多于2mg/g细胞干重的邮青素。
19. 一种细菌细胞，其包含多于5mg/g细胞干重的邮青素。
20. 根据权利要求18所述的细菌细胞，其表达根据权利要求1-17中任一项所述的多种 多聚核巧酸。
21. 根据权利要求19所述的细菌细胞，其表达根据权利要求1-17中任一项所述的多种 多聚核巧酸。
22. -种生成邮青素的方法，包括表达编码邮青素途径的酶的多聚核巧酸，所述多聚核 巧酸包含： (i) 编码八氨番茄红素脱氨酶（cdl)的多聚核巧酸和第一转录调控序列； (ii) 编码目-番茄红素环化酶（Icy-B)的多聚核巧酸和第二转录调控序列； (iii) 编码目-胡萝h素丽化酶（cdW)的多聚核巧酸和第H转录调控序列；并且 其中选择所述第一、第二和第H调控序列，使得所述Icy-B和所述crtW的表达高于所 述crti的表达水平。
23. -种生成邮青素的方法，包括表达编码邮青素途径的酶的多聚核巧酸，所述多聚核 巧酸包含： (i) 编码异戊帰焦磯酸（idi)的多聚核巧酸和第一转录调控序列； (ii) 编码巧牛儿基巧牛儿基焦磯酸合成酶（cd巧的多聚核巧酸和第二转录调控序 列； (iii) 编码前八氨番茄红素焦磯酸合成酶（cdB)的多聚核巧酸和第H转录调控序列； (iv) 编码八氨番茄红素脱氨酶（cdl)的多聚核巧酸和第四转录调控序列； (V)编码目-番茄红素环化酶（Icy-B)的多聚核巧酸和第五转录调控序列； (Vi)编码目-胡萝h素丽化酶（cdW)的多聚核巧酸和第六转录调控序列；和 (vii)编码目-胡萝h素轻化酶（cd幻的多聚核巧酸和第走转录调控序列， 其中选择所述第四、第五和第六调控序列，W致所述Icy-B和所述crtW的表达高于所 述crtI的表达水平。
24. 根据权利要求22所述的方法，其中所述第一调控序列、所述第二调控序列和所述 第H调控序列的每一个均为核糖体结合位点（RB巧。
25. 根据权利要求23所述的方法，其中所述第一调控序列、所述第二调控序列、所述第 H调控序列、所述第四调控序列、所述第五调控序列、所述第六调控序列、所述第走调控序 列的每一个均为RBS。
26. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述第一调控序列、所述第二调控序列和 所述第H调控序列的每一个均为启动子。
27. 根据权利要求22或23所述的方法，其中选择所述调控序列，使得所述Icy-B和所 述crtW的表达比所述crti的表达水平高至少10倍。
28. 根据权利要求25所述的方法，其中选择（iv)的RBS序列，W致使所述crti的表达 达到具有SEQ ID NO:4、5、6或7中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（V)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID NO:2或3中所 列序列的RBS至少80 %的程度； 其中选择（vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID NO:2或3中所 列序列的RBS至少80 %的程度。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中选择（i)的RBS序列，W致使所述idi的表达达 到具有SEQ ID NO:5中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（ii)的RBS序列，W致使所述crtE的表达达到具有SEQ ID N0:5中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（111)的1?5序列，^致使所述(31'巧的表达达到具有569 10^:3中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（iv)的RBS序列，W致使所述crtI的表达达到具有SEQ ID N0:7中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（V)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID N0:2中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（Vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID N0:3中所列序 列的RBS至少80%的程度；并且 其中选择（vii)的RBS序列，W致使所述crtZ的表达达到具有SEQ ID N0:6中所列序 列的RBS至少80 %的程度。
30. 根据权利要求28所述的方法，其中选择（i)的RBS序列，W致使所述idi的表达达 到具有SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80%的程度； 其中选择（ii)的RBS序列，W致使所述crtE的表达达到具有SEQ ID N0:3中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（111)的1?5序列，^致使所述(31'巧的表达达到具有569 10^:7中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（iv)的RBS序列，W致使所述crtI的表达达到具有SEQ ID N0:5中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（V)的RBS序列，W致使所述Icy-B的表达达到具有SEQ ID N0:2中所列序 列的RBS至少80%的程度； 其中选择（Vi)的RBS序列，W致使所述crtW的表达达到具有SEQ ID N0:2中所列序 列的RBS至少80%的程度；并且 其中选择（￥；[;〇的1?85序列，^致使所述(31'12的表达达到具有56〇10^3:2中所列序 列的RBS至少80 %的程度。
31. 根据权利要求22或23所述的方法，进一步包括向细胞内引入编码脱氧木丽 糖-5-磯酸合成酶值XS)的多聚核巧酸。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中选择所述编码DXS的多聚核巧酸的RBS序列，W 致使所述DXS的表达达到具有如SEQ ID NO:6中所列序列的RBS至少80%的程度。
33. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述表达在细菌细胞中实现。
34. 根据权利要求24所述的方法，其中所述每个RBS侧面为间隔序列。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述每个RBS上游的所述间隔序列与SEQ ID NO: 8中所列序列至少80%同源。
36. 根据权利要求34或35所述的方法，其中所述每个RBS上游的所述间隔区与SEQ ID NO: 9中所列序列至少80%同源。
37. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述每个多聚核巧酸包含在单个表达载体 上。
38. 根据权利要求22或23所述的方法，进一步包括在所述表达后分离邮青素。
39. -种分离多聚核巧酸，其包含 (i) 与第一种酶编码序列操作性连接的第一 RBS; (ii) 与第二种酶编码序列操作性连接的第二RBS ;和 (iii) 与第H种酶编码序列操作性连接的第HRBS ; 其中选择所述第二RBS，W致所述第二种酶编码序列的表达水平高于所述第一种酶编 码序列的表达水平； 其中选择所述第H RBS，W致所述第H种酶编码序列的表达水平高于所述第二种酶编 码序列的表达水平； 其中所述第一种酶、所述第二种酶和所述第H种酶为不同酶类并且是相同目标产物的 生物合成途径的各个部分。
40. 根据权利要求39所述的分离多聚核巧酸，进一步包含： (iv) 与第四种酶编码序列操作性连接的第四RBS。
41. 根据权利要求40所述的分离多聚核巧酸，其中所述第四种酶与所述第一、第二和 第H种酶不同并且是所述相同产物的生物合成途径的一部分。
42. 根据权利要求40所述的分离多聚核巧酸，进一步包含： (V)与第五种酶编码序列操作性连接的第五RBS。
43. 根据权利要求42所述的分离多聚核巧酸，其中所述第五种酶与所述第一、第二、第 H和第四种酶不同并且是所述相同目标产物的生物合成途径的一部分。
44. 根据权利要求42所述的分离多聚核巧酸，进一步包含： (Vi)与第六种酶编码序列操作性连接的第六RBS。
45. 根据权利要求44所述的分离多聚核巧酸，其中所述第六种酶与所述第一、第二、第 H、第四和第五种酶不同并且是所述相同目标产物的生物合成途径的一部分。
46. 根据权利要求39-45中任一项所述的分离多聚核巧酸，其中所述每个RBS侧面为间 隔序列。
47. 根据权利要求39所述的分离多聚核巧酸，其中所述目标产物为蛋白质。
48. 根据权利要求39所述的分离多聚核巧酸，其中所述目标产物选自由食品、药品和 燃料组成的组。
49. 一种选择多聚核巧酸序列合成最佳量的目标产物的方法，所述目标产物为包含至 少3种酶的生物合成途径的产物，所述方法包括： (a)在允许于细胞内合成所述目标产物的条件下，将根据权利要求39-48中任一项所 述的多聚核巧酸引入细胞；并且 化）测量所述目标产物的量，其中所述目标产物的量指示要选择的多聚核巧酸序列。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述细胞选自由细菌细胞、哺乳动物细胞、植物 细胞、真菌细胞和藻类细胞组成的组。
【专利摘要】公开了多种编码虾青素途径的酶的分离多聚核苷酸序列。所述多聚核苷酸包括：(i)编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多聚核苷酸和第一转录调控序列；(ii)编码β-番茄红素环化酶(lcy-B)的多聚核苷酸和第二转录调控序列；(iii)编码β-胡萝卜素酮化酶(crtW)的多聚核苷酸和第三转录调控序列；并且其中选择所述第一、第二和第三调控序列，以致所述lcy-B和所述crtW的表达高于所述crtI的表达水平。还公开了使用所述多种多聚核苷酸生成虾青素的方法以及含高水平虾青素的细菌细胞。
【IPC分类】C12N15-52, C12N1-21, C12P23-00, C12N15-67
【公开号】CN104540935
【申请号】CN201380037848
【发明人】龙·米洛, 利奥尔·泽尔布施, 尼瓦·安东诺夫斯基
【申请人】耶达研究及发展有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年7月17日
【公告号】EP2875122A1, US20150211040, WO2014013489A1, WO2014013489A8