一种毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黄酮碳苷提取和纯化工艺，具体涉及一种毛竹叶中四种黄酮碳苷 提取和纯化工艺。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物因其结构和来源不同，溶解特性也有很大差异，因此可根据极性选 择合适的溶剂进行提取。目前，提取方法主要有：水提法、碱性水或稀醇提取法、有机溶剂热 回流提取法、微波辅助萃取法、超声波提取法、超临界萃取法等。
[0003] 水提法，用于黄酮苷类物质提取，成本低，适用于工业生产，但提取液中含蛋白质、 多糖等溶于水的杂质，提取效率低，易霉变，后续分离麻烦。碱性水或稀醇提取法，利用黄酮 类化合物中酚羟基基团溶于碱水遇酸后又沉淀析出的特点，用于黄酮类化合物的提取。在 提取过程中，加入的酸碱浓度要适量，碱浓度过高会破坏黄酮母核结构，而酸浓度过高又会 与黄酮的羟基生成佯盐，导致沉淀物析出后重新溶解，降低得率。有机溶剂热回流提取法， 是目前国内外使用最广泛的提取方法，常用的有机溶剂有乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇等；某 些强极性酚酸（苯甲酸，肉桂酸等）不能完全用纯有机溶剂提取，采用乙醇-水配比混合 液提取效果更佳；二氯甲烷、氯仿、正己烷等某些极性较小的溶剂适用于非极性化合物的提 取，如蜡、留醇、叶绿素等。一定浓度的乙醇或甲醇水溶液最常用于黄酮类化合物的提取，高 浓度的醇溶液（90%以上）适宜于提取苷元，低浓度的醇溶液则适宜于提取苷类。微波辅 助萃取法，是利用不同的物质在微波场中吸收微波能力的差异，待提取物中某些组分首先 被选择性加热，与体系分离后进入介电常数小、微波吸收能力相对差的提取剂，具有高选择 性、后处理方便、对环境安全无害等特点。超声波提取法是利用超声波空化作用，加速植物 有效成分浸出的过程，具有高效、快速、操作简单等特点。超临界流体萃取主要是利用超临 界流体的特性进行分离，超临界流体既有对溶质溶解度大的特征，又有气体易于分散和运 动的特点；当处于临界状态时，温度和压力的微小改变，引起超临界流体密度的显著变化， 从而使其溶解能力也发生相应变化，一般常选用〇) 2作为超临界流体，萃取植物中的有效成 分。超临界流体萃取提取效率高，活性组分和热不稳定成分不易被分解，能耗低，不产生任 何新的"三废"物质，对环境保护有利。研宄人员利用超临界CO2萃取技术从藤茶茎中萃取 黄酮类和酚类物质，并对提取工艺进行优化；还考察了藤茶茎提取物对DPPH自由基清除能 力和与亚铁离子的螯合作用，结果表明，提取物对DPPH自由基表现出极强的清除能力，但 与亚铁离子的螯合作用却很弱，此外，利用HPLC技术从提取物中检测到文献中未报道过 的一些黄酮类化合物，包括芹菜素，牡荆苷，木犀草素等。
[0004] 在实际生产过程中，常用大型设备对竹叶进行热回流提取，提取效率虽不及超声 波提取、微波辅助萃取和超临界流体萃取的效果高，但热回流提取生产成本低，易于操作， 适用于大批量工业化生产。
[0005] 现有技术中涉及的纯化方法主要有大孔树脂吸附法、柱层析、纸层析法、膜分离、 重结晶等。大孔树脂是一类具有大孔结构的高分子聚合物吸附剂，其原理是通过范德华引 力或氢键作用实现对黄酮类化合物的吸附，此外，由于惰性致孔剂除去后残留的多孔性结 构也起到分子筛的作用。大孔树脂具有吸附选择性好、解吸条件温和、使用周期长、再生简 便等优点，并且提取率较高、成本费用低，适合在制备分离工艺中应用，广泛应用于物质的 分离纯化。康家胜等测定了 7种大孔树脂对竹叶总黄酮的吸附与解吸过程，其中AB-8大孔 树脂表现出良好的吸附和解吸性能。聚酰胺树脂通过分子中的酚羟基与树脂中的酰胺基 基团产生氢键作用来实现吸附过程，其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中的羟基数 目、位置以及洗脱剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺树 脂对黄酮类化合物有很好的富集作用，适于黄酮类化合物的大量制备分离工艺。刘会利用 聚酰胺树脂对淡竹叶中黄酮类成分进行纯化，得到最佳工艺，收集70%乙醇洗脱液得淡竹 叶总黄酮，其含量达36%。硅胶柱层析，主要用于分离弱极性的黄酮类化合物，如异黄酮、二 氢黄酮（醇）和高度甲基化或乙酰化的黄酮和黄酮醇，纯化过程中经常选用混合溶剂进行 梯度洗脱，氯仿_甲醇、石油醚-丙酮等都是常用的溶剂洗脱组合。膜分离技术，是在外界 施加压力时，提取液通过滤膜时，高分子被截留的分离技术，可有效去除大分子物质，如蛋 白质、多糖、大分子色素等。在分离过程中，无相变化，且提高了药液澄清度，有效成分含量 也得到很大提高，可实现选择性分离。唐浩国等通过对5种超滤膜的对比研宄，选择切割分 子量为50000D的聚砜膜PSF-500对麻竹竹叶黄酮进行纯化效果更佳，产品得率达4. 29%。 高红宁等也通过陶瓷膜与醇沉的分离效果对比，结果表明微滤结合大孔树脂纯化技术对苦 参水提液中总黄酮处理的吸附率及除杂效果更佳。纸层析和重结晶工艺在文献中也有涉 及，但均存在不同程度的缺点而限制了其工业化生产。
[0006] 现今，也有很多专利报道过竹叶黄酮的纯化方法，郭雪峰等得到至少50%的总黄 酮，专利采用乙醇提取，石油醚或乙醚去脂处理，大孔树脂柱分离，超滤膜和纳滤膜截留大 分子物质，最后得竹叶黄酮粗提物。王成章等采用HPLC法从30种竹叶中筛选黄酮含量高 的竹种作为生产原料，Ci?C3醇提取，浓缩，陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜过滤，再经大孔树脂纯 化后得黄酮含量达40%?65%竹叶黄酮提取物。
[0007] 随着竹叶黄酮成分的明确，其应用价值也得到学者们的关注，主要应用在食品，医 药保健，化妆品等行业。通过对国家发明专利的搜索，已有诸多专利对黄酮有效成分加以提 取并利用。张英将适量竹叶黄酮添加到啤酒中，生产出竹啤饮料，不仅保留了啤酒的营养价 值和口味，还具有促进身体微循环，降低血脂等多重保健功能，同时带有典型的竹子清香。 也有用竹叶黄酮开发血栓性疾病预防或治疗的药物或保健品。此外，胡林福和陈永健结合 膜处理工艺，将竹叶黄酮用于饲料添加剂，保健食品原料，食品添加剂，医药中间体和化妆 品原料的收集，这些产品具有提取率高、工艺流程简单、产品纯度高等特点。刘志河和李伟 试图将竹叶黄酮类物质加入口腔清洁护理产品中，不但可去除异味，还具有消炎抑菌，防治 口腔疾病之功效，此外对口腔中的溃疡面有一定的修复作用。可见竹叶黄酮对人类健康具 有十分重要的作用。
[0008] 竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史，近年来对竹叶资源化学利用的研宄也在 逐年增多，但在竹叶提取物方面的研宄依旧有不足之处，需要进一步深入研宄。
[0009] 目前，以竹叶四种黄酮碳苷（荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷）为对象进行 的提取纯化工艺的优化还比较少，纯度相对较低，还没有实现工业化生产。
【发明内容】
[0010] 针对目前存在的问题，本发明提供一种毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺， 以毛竹为研宄对象，以四种黄酮碳苷的得率为指标，对毛竹叶四种黄酮碳苷提取和纯化工 艺进行优化，使得在优化条件下，四种黄酮碳苷的提取率和纯度都最高，可以用作医药中间 体或功能性保健食品开发的原料，为实现黄酮碳苷的工业化生产打下基础。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
[0012] 毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺，所述的四种黄酮碳苷为荭草苷、异荭草 苷、牡荆苷和异牡荆苷，包括如下步骤：
[0013] (1)准确称取毛竹叶粉末，加入乙醇水溶液中进行热回流提取，重复提取4次， 过滤并将滤液合并得提取液；所述热回流提取的工艺为：70%?80%的乙醇，料液比为 1 : 15?1 : 25,60?80°〇恒温水浴提取1?311;
[0014] (2)采用减压蒸馏法除去提取液中的有机溶剂，加入与提取液等体积的石油醚萃 取，除去色素和脂溶性成分，重复萃取三次，得到毛竹叶黄酮粗提物，石油醚回收，循环使 用；
[0015] (3)经聚酰胺树脂再次进行纯化处理：将毛竹叶黄酮粗提物经大孔树脂进行纯化 处理：大孔树脂进行预处理，将毛竹叶黄酮粗提物上大孔树脂柱，湿法装柱，加入IOmg 竹叶黄酮粗提液，控制流速3BV*h'大孔树脂与样品上样量比为5 : 1，收集样品流出液， 流出液重复上柱3次后，用15 %乙醇溶液以4BV?IT1的流速初步洗脱除杂，浓缩洗脱液， 然后用60 %的乙醇溶液以4BV?IT1流速洗脱，最后收集60 %乙醇洗脱液，浓缩并冷冻干燥 得纯化后毛竹叶黄酮干粉；
[0016] (4)将上述大孔树脂纯化后的竹叶黄酮粉末，溶解后，将聚酰胺树脂湿法装柱于 2cmX35cm层析柱中，装柱高度为12. 5cm，加入IOmg?ml/1上述竹叶黄酮干粉配制的溶液， 控制3BV 流速过柱，收集流出液，重复上柱3次，再用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓缩，接 着用等体积40%乙醇溶液洗脱，最后收集40 %乙醇洗脱液，浓缩并冷冻干燥得纯化后的竹 叶黄酮干粉。
[0017] 上述毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺中，经过试验筛选，所述热回流提取 的工艺优选为：75%乙醇、料液比I: 20、70°C下恒温水浴提取2h。
[0018] 上述毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺中，所述的大孔树脂为ADS-17、DM130 或D101，优选为D101。
[0019] 上述毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺中，所述聚酰胺树脂的粒径为 0. 15 ?0. 25mm。
[0020] 上述毛竹叶中四种黄酮碳苷提取和纯化工艺中，在经大孔树脂或聚酰胺树脂进行 纯化处理前，对大孔树脂或聚酰胺树脂进行预处理，具体如下：
[0021] 用无水乙醇洗去细小树脂及杂质，然后