一种辅酶q10发酵工艺及控制策略的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种辅酶QlO发酵工艺及控制策略。
【背景技术】
[0002]辅酶QlO结合在动植物、微生物细胞内线粒体膜上，是呼吸链一个重要的递氢体，是一种有效的生化药物，具有很多重要的生理作用。多项数据证明辅酶QlO对人类的健康及疾病治疗越来越重要，近期研宄发现辅酶QlO具有抗衰老作用，已经广泛应用到化妆品及保健品领域，国内外需求进一步扩大。
[0003]辅酶QlO的生产方法主要有动植物组织提取法、化学合成法以及微生物发酵法三种。其中动植物提取法成本太高，不适合工业化生产；化学合成法反应复杂，副产物多，成本也较高，目前国内外大多都是采用微生物发酵法。微生物发酵法有如下优点:(I)产品为天然品，生物活性好，易于人体吸收；(2)原料来源广泛，利于工业化生产。
[0004]要提高辅酶QlO发酵产量主要从两个方面进行优化:一是选育出辅酶QlO高产菌株，二是优化发酵培养基和发酵工艺。确定生产菌株及发酵培养基后，需要对发酵条件进行优化，摇瓶及小罐试验阶段可以通过单因素等其他统计学的方法来进行优化，在生产上利用这一手段去优化时情况较复杂且工作量大，微生物发酵过程长，发酵结果具有一定的波动性，对最终结果分析造成一定的干扰，影响判断，重复性低，效率低等缺点。
[0005]本发明提供了一种辅酶QlO发酵的具体操作方法，建立了一个工艺参数调控的标准，通过观察发酵过程中菌型变化，以各个菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，只需观察菌型的变化即可掌握菌型过渡期，恰当的调整发酵工艺参数使菌体正常的过渡到下一个菌型，具有易控性及简便性，波动性小，从而使辅酶QlO发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的问题是提供一种辅酶QlO工艺及控制策略，建立以菌体在发酵过程中菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间点及调整幅度的技术手段，为辅酶QlO发酵提供最优发酵条件，从而提高辅酶QlO发酵产量。
[0007]本发明步骤如下:
[0008]I)平板培养
[0009]配置平板培养基，所述的平板培养基的组分为:葡萄糖2.0?4.0g/L，酵母粉1.0?3.0g/L，蛋白胨1.0?3.0g/L，琼脂粉20?30g/L，消前ρΗ6.8?7.2，于121 °C灭菌25 ?30mino
[0010]从平板上挑取一个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10?14mL无菌水试管后充分打散，稀释到一定梯度后吸取少量菌液于平板上涂布，于32?34°C培养5?7天。
[0011]2)母瓶培养
[0012]配置母瓶培养基，所述母瓶培养基的组分为:氯化铵1.7?2.5g/L，蛋白胨0.7?1.5g/L，味精0.4?1.2g/L，玉米楽0.4?1.2g/L，葡萄糖2?6g/L，磷酸氢二钠0.35?0.55g/L，磷酸二氢钠 0.35 ?0.55g/L，三氯化铁 0.08 ?0.12g/L，硫酸镁 1.4 ?2.2g/L，氯化钾1.4?2.2g/L，硫酸铜0.02?0.06g/L，氯化锌0.0006?0.00014g/L，碳酸氢钙5.6?7.2g/L，辅液I。其中辅液I组分为:盐酸硫胺I?3g/L，核黄素1.8?2.4g/L，吡哆素10?15g/L，叶酸0.5?1.5g/L，烟酸12?16g/L，烟酸胺12?16g/L，泛酸钙0.2?0.6g/L，苯丙氨酸0.4?1.2g/L，前尼醇4?8g/L。除辅液I之外于121°C灭25?30min，辅液I于118°C灭20?25min，按体积比0.2?0.6%加到母瓶培养基中。
[0013]从平板上挑取25?30个外观圆润、边缘光滑、颜色较深的单菌落于装有10?14mL无菌水试管充分打散，每个母瓶接2.3?3.2mL菌悬液，培养条件为转速220?240rpm，温度32?34°C，培养25?30h，待残糖为0.5?1.5g/L时按5?10 %接种量接入一级种子罐。
[0014]3) 一级种子罐培养
[0015]配置一级种子培养基，所述的一级种子培养基的组分为:氯化铵2?4g/L，蛋白胨0.8?1.6g/L，味精0.6?1.8g/L，玉米楽0.6?1.8g/L，葡萄糖4.8?9.6g/L，磷酸氢二钠0.4?0.8g/L，磷酸二氢钠0.4?0.8g/L，三氯化铁0.08?0.14g/L，硫酸镁L 6?3.2g/L，氯化钾1.6?2.4g/L，硫酸铜0.02?0.06g/L，氯化锌0.0006?0.00014g/L，碳酸氢钙
5.6?7.2g/L，辅液II。其中辅液II组分为:盐酸硫胺10?15g/L，核黄素0.5?1.5g/L，吡哆素1.5?2.5g/L，叶酸0.25?0.75g/L，烟酸6?12g/L，烟酸胺6?12g/L，泛酸钙0.15?0.45g/L，苯丙氨酸0.2?0.6g/L，前尼醇3?9g/L。
[0016]消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4?6.7，除辅液II之外于121 °C灭25?30min后降至培养温度并通空气保压，辅液II装容器于118°C灭20?28min。待母瓶残糖< 0.5?lg/L时即可一级移入种子罐，移种前将母瓶的菌液和辅液II分别装进一个耐压的容器，在火焰保护下用差压法由接种口先压入消好的辅液II，再压入母瓶种子液，接种量为5%?10%，辅液II用量为0.4?0.8%，一级种子罐培养条件为罐压0.03?0.04MPa，vvm (λ 6?(λ 8，罐温为32?34°C，转速180?220rpm，培养周期16?24h。待残糖降至
0.5?1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将一级种子移入二级种子罐，接种量为5?10 %。
[0017]4) 二级种子罐培养
[0018]配置二级种子罐培养基，所述培养基组分为氯化铵2.6?3.8g/L，蛋白胨1.6?3.2g/L，味精0.6?1.2g/L，玉米楽0.6?1.2g/L，葡萄糖10?15g/L，磷酸氢二钠0.6?
1.2g/L，磷酸二氢钠0.6?1.2g/L，三氯化铁0.15?0.25g/L，硫酸镁3?6g/L，氯化钾
1.6 ?2.4g/L，硫酸铜 0.02 ?0.06g/L，氯化锌 0.0005 ?0.0015g/L，碳酸氢钙 5.6 ?7.2g/L，辅液III。其中辅液III组分为盐酸硫胺10?20g/L，核黄素1.5?3g/L，吡哆素2?4g/L，叶酸 0.4 ?1.0g/L,烟酸 15 ?25g/L，烟酸胺 15 ?25g/L，泛酸钙 0.001 ?0.004g/L，苯丙氨酸 0.002 ?0.006g/L，茄尼醇 0.04 ?0.08g/L。
[0019]消前用液氨将二级种子培养基pH调至6.4?6.7，除辅液III之外于121°C灭25?30min后降至培养温度并通无菌空气保压，辅液III放入小罐中于120°C灭20?25min后降室温通无菌空气保压。在一级种子移入二级种子罐前先将辅液III通过压差法全部移入二级种子罐，辅液III的用量相对于接后的0.1?0.4%。二级种子罐培养条件为罐压0.03?0.04MPa，vvm 0.6?0.8，罐温为32?34°C，转速180?220rpm，培养周期16?24h待残糖降至0.5?1.5g/L，菌型均匀且无菌度合格后，将二级种子罐移入三级种子罐，接种量为5?10%。
[0020]5)三级发酵罐培养
[0021]配置三级发酵培养基，所述培养基组分为氯化铵3.6?4.8g/L，蛋白胨0.6?
1.2g/L，味精2.0?6.0g/L,玉米楽3.0?6.0g/L,葡萄糖10?15g/L，磷酸二氢钠2.5?3.5g/L，三氯化铁0.8?L 4g/L，硫酸镁6?9g/L，氯化钾L 5?3.0g/L,硫酸铜0.06?0.12g/L，辅液IV。其中辅液IV组分为:盐酸硫胺I?3g/L，核黄素1.8?2.4g/L，吡哆素10?15g/L，叶酸0.5?1.5g/L，烟酸12?16g/L，烟酸胺12?16g/L，泛酸钙0.15?0.45g/L，苯丙氨酸 0.25 ?0.75g/L，茄尼醇 2.5 ?5g/L。
[0022]先在配料罐中加入少于配料体积的水，开搅拌，然后逐次加入除辅液IV外培养基其它组分，待搅拌均匀后用泵打入大罐中，再用水清洗配料罐后一并打入发酵罐后，加水至所需要的体积，于121?122°C灭菌30min后冷却通气保正压。辅液IV放入小罐中于120°C灭20?25min后降温通无菌空气保压，接种前通过压差法将辅液IV全部压入三级发酵罐中，用量为0.15?0.45%，通过压差法将二级种子压入三级发酵罐中，初始培养条件为罐压0.03?0.035MPa，转速60?70rpm，vvm0.42?0.46，罐温32?34°C，初始糖浓度10?15g/L，磷浓度0.3?0.4g/L。接种后每隔四个小时取样测糖、磷，并镜检观察菌型，前40h糖控制7?12g/L，磷0.2?0.3g/L，后期至发酵结束糖控制3?6g/L，磷控制0.1?0.15g/L，通过补加液氨控制pH 7.0?7.4。
[0023]发酵初期，菌型为小球，菌体出现二分裂时vvm提高至0.48?0.54，在菌体有出现短棒状时vvm提至0.54?0.6，耀压0.035?0.04Mpa，转速提高至75?90rpm。待菌型由短棒状开始转为弯形时提高通气比至vvm 0.6?0.68，罐压为0.45?0.5Mpa，转速提高至95?105rpm。待菌型由弯形转变为大圆球形时vvm降低至0.52?0.58，耀压降至0.035?0.04Mpa，待辅酶QlO含量增长减缓，糖耗速度明显减慢，菌体染色浅，残糖< 0.5?1.5g/L后可以停止发酵。
[0024]在本发明的实施方案中，该方法可应用于任何产辅酶QlO的菌种，作为一种【具体实施方式】，使用的菌种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已于2010年12月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为CGMCC N0.4497。
[0025]在本发明的实施方案中，“消前”调节pH在本领域是指在培养基进行蒸汽高温灭菌前的一个操作，一般都在灭菌前操作。
[0026]在本发明的实施方案中，工艺调控依据都是在三级发酵期间通过菌型变化来判断工艺参数调整时间及幅度。
[0027]本发明取得有益效果:通过观察发酵过程中菌型变化，以各个菌型过渡期作为判断工艺参数调整的时间及幅度的依据，只需观察菌型的变化即可掌握菌型过渡期，恰当的调整发酵工艺参数使菌体正常的过渡到下一个菌型，具有易控性及简便性，波动性小，从而使辅酶QlO发酵水平有了大幅度的提升，生产水平稳定，降低发酵成本。
[0028]本领域中通常按照固定时间去调整通气比、转速、罐压，其辅酶QlO产量要偏