一种通过酶催化反应合成水飞蓟宾的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过酶催化反应合成水飞蓟宾的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002] 水飞蓟素（Silymarin)是从菊科植物水飞蓟（Silybum marianum Linn. Gaertn) 中提取出的一种黄酮类化合物，具有多种临床功效，已被多国药典收录。水飞蓟宾（Silybin 或Silibinin)是水飞蓟素的4种异构体中含量最高，活性最好的1种，由一分子黄杉素 (Taxifolin)和一分子松柏醇（Coniferyl alcohol)通过氧化偶合而成。
[0003] 目前，人们获取水飞蓟宾的主要手段是从水飞蓟种子中提取。然而，该提取工艺复 杂，成本较高；水飞蓟的生长收到季节和环境的影响，且占用耕地；提取过程中使用有机溶 剂等，产品的安全性受到威胁。近年来，有人通过金属离子（Ag 2O等）催化的方法，以松柏 醇和黄杉素为底物合成了水飞蓟宾的4种同分异构体。然而，该合成过程依然是在有机溶 剂中进行的，且反应时间较长（96h)。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的问题是提供一种通过酶催化反应合成水飞蓟宾的方法，以过氧化 物酶作为催化剂，以黄杉素、松柏醇作为底物，只需要简单地控制反应体系的pH、温度等条 件，即可实现水飞蓟宾的合成，是一种安全高效的方法。
[0005] 所述的过氧化物酶为一类含有血红素的酶类，以过氧化氢为电子受体来催化底物 氧化，能够氧化多种有机和无机化合物。
[0006] 所述的底物为松柏醇和黄杉素，二者的氧化偶合需要过氧化氢作为电子受体。
[0007] 反应体系的pH为适合酶催化反应的pH，通过添加 pH缓冲对控制。
[0008] 反应体系的温度为适合酶催化反应的温度。
[0009] 反应介质为水溶液。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，反应介质是磷酸盐缓冲液，以ΚΗ2Ρ04/Κ 2ΗΡ04缓冲对 控制pH。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，反应产物为水飞蓟宾的4种同分异构体（水飞蓟宾 A、异水飞蓟宾A、水飞蓟宾B和异水飞蓟宾B)。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，松柏醇、黄杉素、H2O2的摩尔比为2:1:1。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，以pH7. 0的磷酸缓冲液为反应介质，松柏醇浓度为 0. 09mM/mL，松柏醇、黄杉素、H2O2的摩尔比为2:1: 1，酶的用量为5U/mL，在25°C条件下反应。 该反应在25°C条件下进行5min，水飞蓟宾的最大产量达到18. 52mg/L，相对于黄杉素和H2O2 的转化率均为85. 31%。
[0014] 本发明的一种实施方式，是以磷酸盐缓冲液作为反应介质，向反应体系中添加足 量过氧化氢，反应底物为松柏醇和黄杉素。水飞蓟宾的最大产量达到18. 52mg/L，为理论最 大产量（21. 71mg/L)的 85. 31 %。
[0015] 本发明的有益之处：本发明创建了一种使用酶催化合成水飞蓟宾的方法。在传统 的金属离子催化水飞蓟宾合成反应中，1分子黄杉素和2分子松柏醇在含有4分子Ag 2O的 乙酸乙酯中反应96小时，可以得到4种水飞蓟宾的同分异构体，其转化率为52%，反应在 75°C条件下进行。本发明所述反应在水相介质中进行，避免了有机溶剂的使用，既简化了产 物分离纯化的成本，同时提高了安全性。该酶促反应迅速，当反应体系中存在足量过氧化氢 时，在5min之内即可生成18. 52mg/L水飞蓟宾（4种水飞蓟宾同分异构体的总和，下同），达 到理论最大产量的85. 31%。该反应条件要求简单，只需要对反应温度和pH进行简单控制 即可，且反应温度接近常温，pH为中性。
【附图说明】
[0016] 图1阴离子模式下水飞蓟宾的质谱图。其中，481. 1140m/z为在阴离子模式下，水 飞蓟宾脱氢的同位素峰之一。
[0017] 图2预测和实测的水飞蓟宾同位素峰。其中，A为C25H220 1Q[M-H]_:预测481. 1140m/ z ;B 为实测 481. 1140m/z。
[0018] 图3过氧化氢存在条件下，过氧化物酶催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾反应体 系的色谱图。其中，8、9、10、11分别为水飞蓟宾的4种同分异构体。
[0019] 图4过氧化氢不足条件下水飞蓟宾的催化合成。其中，折线图表示水飞蓟宾的产 量；柱状图表示水飞蓟宾相对于黄杉素的转化率。
[0020] 图5足量过氧化氢条件下水飞蓟宾的催化合成。其中，折线图表示水飞蓟宾的产 量；柱状图表示水飞蓟宾相对于黄杉素的转化率。
[0021] 图6过氧化氢存在条件下，过氧化物酶催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾可能的 反应机理。
【具体实施方式】
[0022] 材料与方法
[0023] 松柏醇、黄杉素和水飞蓟宾标准品购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)，辣根过氧 化物酶（horseradish peroxidase, HRP)和30%的双氧水购自生工生物工程（上海）有限 公司。松柏醇、黄杉素和水飞蓟宾溶于甲醇（Sigma-Aldrich，HPLC grade)，配制成lg/L的 标准品。
[0024] 0· IM 磷酸钾缓冲液（PP Buffer, ρΗ7· 0):将 0· 53g KH2POjP I. 06g K2HPO4 在超纯 水中溶解，检查pH为7. 0,以超纯水定容至100mL。将缓冲液于冰上保存，使用前于25°C平 衡。
[0025] 准确称取一定质量的松柏醇和黄杉素，分别以PP Buffer (pH7. 0)溶解并定容至 I. 2mM和 0· 6mM ;以PP Buffer(pH7. 0)将 30%双氧水定容至 122. 3mM。以PP Buffer(pH7. 0) 将辣根过氧化物酶溶解为30000U/mL。松柏醇、黄杉素和双氧水溶液于4°C避光保存，过氧 化物酶溶液于_20°C避光保存，使用前在冰上溶解。反应在黑暗条件下、25°C金属浴中进行， 反应结束后立即加入一定体积的甲醇终止酶反应，并置于冰上、避光，直到进样分析。
[0026] 产物水飞蓟宾的鉴定使用SHIMADZU UPLC-MS-IT-T0F进行：
[0027] (1)样品经0. 22 ym水系滤膜过滤后，以自动进样器进UPLC-MS-IT-T0F进行分析， 进样体积10 μ L。
[0028] (2)流动相A :0.1 % (v/v)甲酸，流动相B :100%甲醇；洗脱梯度（以流动相B 的百分比表示）：〇min 30%、30.00min 55%、35.00min 55%、40min 30%;总流速 0.2mL/ min ;紫外检测器，检测波长288nm ;柱温箱温度40°C ;质谱设置为阴离子模式，采集范围 100_700m/z，离子富集时间10. 00msec，重复次数3,检测器电压：相对于调谐电压。
[0029] (3)分别准确配制2. 5、5. 0、10、20、40、80、100mg/L的水飞蓟宾标准品。标准品的 分析方法与样品的分析方法相同。以标准品的浓度作为纵坐标，以相应提取离子流（m/z = 482. 1140)的峰面积作为横坐标，绘制标准曲线。以阴离子模式下，样品提取粒子流（m/z = 482. 1140)的峰面积，通过标准曲线方程计算样品中水飞蓟宾的浓度。
[0030] 实施例1过氧化物酶催化水飞蓟宾合成的验证
[0031] 为了验证过氧化物酶催化松柏醇和黄杉素合成水飞蓟宾的能力，以松柏醇和黄杉 素作为底物，在H 2O2存在的条件下，由辣根过氧化物酶（HRP)催化水飞蓟宾的合成。分别验 证了省却底物、H 2O2或酶时，水飞蓟宾的产生情况，如表1。
[0032] 水飞蓟宾的合成反应的化学反应式如图6所示，理论上，每合成1分子水飞蓟宾需 要1分子的H 2O2参与反应，松柏醇与黄杉素的摩尔比为2:1时，为水飞蓟宾合成的最优底物 比例。鉴于水飞蓟宾同时又会被反应体系中的H 2O2所降解，因此，我们首先在过氧化氢不足 (摩尔数约为黄杉素的45. 3% )、且松柏醇：黄杉素的摩尔比为2:1的条件下进行反应，反 应体系如表1所示。在此情况下，反应体系中的H2O 2为限制性的底物。但是在计算底物的 转化率时，依然以黄杉素作为参考。
[0033] 准确称取一定质量的松柏醇和黄杉素，分别以PP Buffer (pH7. 0)溶解并定容至 I. 2mM和 0· 6mM ;以PP Buffer(pH7. 0)将 30%双氧水定容至 122. 3mM。以PP Buffer(pH7. 0) 将辣根过氧化物酶溶解为30000U/mL。松柏醇、黄杉素和双氧水溶液于4°C保存，过氧化物 酶溶液于_20°C保存，使用前在冰上溶解。反应在25°C避光条件下进行，反应时间为45min。 反应结束后立即加入98 μ L甲醇以终止酶反应，并置于冰上、避光，直到进样分析。所有反 应均进行3次，取平均值。
[0034] 表1过氧化物酶催化水飞蓟宾合成的验证
[0035]
【主权项】
1. 一种通过酶催化反应合成水飞蓟宾的方法，其特征在于，以过氧化物酶作为催化剂， 以黄杉素、松柏醇作为底物，以过氧化氢为电子受体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶为一类含有血红素的酶 类，以过氧化氢为电子受体来催化底物氧化，能够氧化多种有机和无机化合物。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的pH为适合酶催化反应的pH。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的pH通过添加 pH缓冲对控制。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系的温度为适合酶催化反应的温 度。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应介质为水溶液。
7. 根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，反应介质是磷酸盐缓冲液，以KH2PO4/ K2HPO4缓冲对控制pH。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，松柏醇、黄杉素、H2O2的摩尔比为2:1:1。
9. 根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，以pH7. 0的磷酸缓冲液为反应介质， 松柏醇浓度为0. 09mM/mL，松柏醇、黄杉素、H2O2的摩尔比为2:1: 1，酶的用量为5U/mL，在 25°C条件下反应。
【专利摘要】本发明公开了一种通过酶催化反应合成水飞蓟宾的方法，属于生物化工领域。发明在过氧化氢存在的条件下，以过氧化物酶催化松柏醇和黄杉素合成了水飞蓟宾的4种同分异构体。该反应在水相中进行，避免了有机溶剂的使用；反应的效率较高，在5min内即可生成18.52mg/L水飞蓟宾，转化率为85.31％。该方法是一种安全且高效的合成水飞蓟宾合成方法。
【IPC分类】C12P17-16
【公开号】CN104561177
【申请号】CN201510042186
【发明人】周景文, 陈坚, 吕永坤, 堵国成
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月27日