一种树脂固定卤醇脱卤酶催化合成(r)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种阿伐他汀中间体的制备方法，尤其设及一种树脂固定面醇脱面酶 催化合成（时-4-氯基-3-径基下酸乙醋的工艺，属于医药化工领域。
【背景技术】
[0002] 科学家研究发现他汀类药物不仅具有强大的降脂作用，还具有多种功效，它能改 善血管内屯、肌细胞重塑和抑制屯、脏电生理重塑，防止屯、肌细胞调亡和调节屯、脏植物神经功 能等等。他汀类药物的出现是屯、血管疾病治疗史上一个重要的里程碑，并成为目前临床上 用于智联各类高脂血症、防治动脉粥样硬化及冠屯、病的助理血脂调剂药物，也是全球医药 市场著名的"重磅炸弹"级药物。阿托伐他汀巧是目前世界上最杨销的降血脂药，是HMGCoA 还原酶抑制剂。阿托伐他汀巧手性侧链有两个径基，是与HMGCoA还原酶识别的药效团，合 成侧链设及的中间体主要有ATS-5和（3R，5S)-6-氯二径基己酸叔下醋。其中，ATS-5是关 键中间体。
[0003] 目前合成ATS-5 ((时-4-氯基-3-径基下酸乙醋）的方法主要有不对称合成法和 微生物转化法等。发酵法制备ATS-5还处于实验室研究阶段，并且存在效率低的问题；不对 称合成技术是使用一种对映体催化剂，与一种底物进行反应，使之只形成一个对映体的手 性化合物的不对称合成方法。其中又可分为化学催化不对称还原和生物催化不对称还原。
[0004] 不对称合成又称为手性合成，它W具有手性活性中屯、的物质作为原料，在保留活 性中屯、的前提下通过化学方法或者生物方法，合成新的手性化合物。化学不对称法合成 ATS-5需要手性底物作为原料，使用的手性催化剂大多含重金属且合成技术复杂，重金属也 会对环境造成污染，治理污染导致成本偏高，最终产物的光学纯度也低于生产要求，因此不 适用于制药行业。
[0005] 为了提高ATS-5的收率特别是其光学纯度及减少污染，酶法制备ATS-5工艺得到 了广泛的研究。常用的酶主要有面醇脱面酶巧C4. 5.X.X)、幾基还原酶巧C1. 1. 1. 184)、 腊水解酶巧C3. 5. 5. 1)和脂肪酶巧C3. 1. 1. 3)。研究表明，脂肪酶催化时，经过化反应，尽 管ATS-5的收率可达99 %，但手性成份只有50 %。Moen研究表明，在脂肪酶催化下，氨化率 为98 %，中间体进一步在其他催化剂下发生反应，ATS-5收率可达95 %，然而，由于后一步 催化剂太贵，限制其工业化应用。腊水解酶催化W3-径基戊二腊为起始底物，合成ATS-5。 Robedson等从DNA文库中得到137种腊水解酶，发现其中一种可催化3-径基戊二腊去对 称生成ATS-5,其收率可达98 %，然而随着底物浓度增加，手性化合物含量则下降，因而限 制其规模化生产。幾基还原酶催化时，需要添加NADH，而通过外部直接添加NADH无疑会增 加成本，工业上没有实际可操作性为此，研究通过构建辅酶再生系统来提高幾基还原酶催 化效率，如通过Leifsonia产生乙醇脱氨酶催化合成手性化合物进一步再生辅因子；通过 Candidama即oliae产生幾基还原酶及Bacillusmegaterium产生葡萄糖脱氨酶相偶合，催 化C0邸生成（S) -CHBE，然而，上述研究目前尽限于实验室规模，离工业化生产还有一定距 离。
[0006] 与幾基还原酶、腊水解酶和脂肪酶相比，面醇脱面酶（HHDH)具有一定优势，在不 需任何辅酶情况下，HHDH催化底物（S)-4-氯-3-径基下酸乙醋（ATS-4)脱去面元素，成 环氧化合物，后者受到氯基进攻，转化为ATS-5。合成过程中，HHDH起重要催化作用（如下 式）。
[0007]
[0008]ATS-5作为高新技术认定产品，W(S) -4-氯-3-径基下酸乙醋为底物，在HHDH催 化下，脱去氯，成环氧化合物，后者与氯化钢经过化反应，生成ATS-5。所生成的混合液首先 通过活性碳吸附，去除HHDH残留物及其他杂物，过滤得到含ATS-5上清液，醋酸乙醋萃取， 蒸馈及精馈，得ATS-5终产品。
[0009] 尽管目前该产品已产业化，整个反应已完成小试，其中用75血(48U/mL)脱面酶催 化反应45g(巧-4-氯-3-径基下酸乙醋，在溫度为49°C，抑在6. 90-7. 00之间，反应6小时 之后（S) -4-氯-3-径基下酸乙醋转化率为95 %，ATS-5得率为86 %，具有较高的工业应用 价值，但该工艺仍存在W下问题：
[0010] ①HHDH的去除。尽管通过活性碳吸附回收ATS-5同时去除HHDH，部分酶仍有残 留，经过后期蒸馈及精馈工艺，HHDH分解成小分子物质，残留在产品中，对后续提纯造成了 很大影响，降低了ATS-5的收率和光学纯度；
[0011] ②由于酶与底物是一次性加入，所WHHDH反应一次后就去除，一方面造成去除 HHDH时工艺繁多，同时HHDH不能重复利用，因而导致整个工艺生产成本上升；
[0012] ③由于所用HHDH为胞内酶，粗酶液中除含有HHDH，还含有其他杂蛋白质等，通过 活性碳吸附回收ATS-5时，部分杂蛋白会残留ATS-5中，无疑增加整个工艺复杂程度，导致 终产品纯度不高、生产成本却增加。
【发明内容】
[0013] 本发明要解决的技术问题是：提供一种树脂固定面醇脱面酶催化合成（时-4-氯 基-3-径基下酸乙醋的工艺，反应条件溫和，无酶残留，酶可重复利用，反应速度快，成本 低，产物得率高，并且没有副反应存在，适合工业化大生产。
[0014] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0015] 一种树脂固定面醇脱面酶催化合成（时-4-氯基-3-径基下酸乙醋的工艺，包括如 下步骤：
[0016] 1)将吸附树脂用蒸馈水浸泡，去杂，然后在揽拌条件下用碱液和酸液交替浸泡 2-4次，最后用蒸馈水冲洗至中性，得预处理吸附树脂，并用吸附树脂的2倍体积W上的4Γ 的蒸馈水浸泡待用；
[0017]。配制48U/mL的面醇脱面酶溶液，在4°C的条件下放置待用；配制0.Imol/L、抑 为6. 5-8. 0憐酸氨二钢-憐酸二氨钢缓冲液待用；
[001引 3)将30g预处理的吸附树脂加入到50-150mL的面醇脱面酶溶液中，用憐酸氨二 钢-憐酸二氨钢缓冲液调节抑至6. 8-7. 4,并在15-30°C的条件下，揽拌4-lOh，得吸附树脂 固定面醇脱面酶；
[001引 4)称取207g蒸馈水、1.5-2. 5g氯化钢，逐一加入四口烧瓶中，并调节抑至 7. 5-8. 5 左右；
[0020] 5)加入40-50g底物ATS-4,并升溫，待溫度大于46°C时加入15g吸附树脂固定面 醇脱面酶，反应1-地，调节抑为6. 90-7. 05,用有机溶剂萃取、精馈，得（时-4-氯基-3-径 基下酸乙醋。
[0021] 具体地，所述吸附树脂为DH110树脂、311树脂或AB8树脂（江苏临海树脂科技有 限公司）。
[0022] 具体地，所述步骤1)中在揽拌条件下用碱液和酸液交替浸泡工艺为：先用3-5倍 吸附树脂体积的3-5wt%的化0H溶液浸泡吸附树脂至少比，然后用蒸馈水冲洗至中性，再 用2-3倍吸附树脂体积的3-5wt%的肥1溶液浸泡吸附树脂至少0.化，最后用蒸馈水冲洗 至中性。
[0023] 作为优选，所述步骤3)中面醇脱面酶溶液的体积150血。
[0024] 作为优选，所述步骤3)中揽拌溫度为25°C。
[0025] 作为优选，所述步骤3)中揽拌时间为化。
[0026] 作为优选，步骤5)的反应溫度为47-52Γ。
[0027] 作为优选，步骤5)的反应时间为地。
[002引作为优选，步骤5)中调节抑为6. 98。
[0029] 作为优选，步骤5)的有机溶剂为乙酸乙醋或二氯甲烧。
[0030] 本发明的有益效果是：本发明提供的一种树脂固定面醇脱面酶催化合成 (时-4-氯基-3-径基下酸乙醋的工艺，W(S)-4-氯-3-径基下酸乙醋（ATS-4)为底物，采用 酶法合成ATS-5,针对酶法反应速率和转化率较低的缺陷，选取树脂为载体，吸附法皿皿， 该法能使得酶重复利用，提高底物转化率及产物得率，从而降低生产成本，经试验，HHDH的 固定率在45%W上，第一次ATS-5产物生成率在75%W上，甚至高达94. 13%，固定化酶回 收利用之后第二次转化率在35%W上，最高至50%，反应条件溫和，无酶残留，酶可重复利 用，反应速度快，成本低，产物得率高，并且没有副反应存在，适合工业化大生产。
【具体实施方式】[00引]实施例1
[0032] 一种树脂固定面醇脱面酶催化合成（时-4