述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列（脑心肌炎 病毒5'非编码区）；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒）前导序列；人 类免疫球蛋白质重链结合蛋白质（BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序 列（AMVRNA4);烟草花叶病毒（TMV)前导序列。
[0051] 所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒（CaMV)增强子、玄参花叶病毒（FMV) 增强子、康乃馨风化环病毒（CERV)增强子、木薯脉花叶病毒（CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病 毒（MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒（CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMV)、鸭 跖草黄斑驳病毒（CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒（PCLSV)增强子。
[0052] 对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛 素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言， 所述内含子包含但不限于，CAT-I内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和"超级泛素"内 含子。
[0053] 所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限 于，来源于农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶（NOS)基因的多聚腺苷酸 化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II(pinII)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆 ssRUBISCOE9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于a-微管蛋白（a-tubulin)基因的 多聚腺苷酸化信号序列。
[0054] 本发明中所述"有效连接"表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对 相连序列来说需要的功能。在本发明中所述"有效连接"可以为将启动子与感兴趣的序列 相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并 且想要获得该蛋白的表达时"有效连接"表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得 到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋 白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起 始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的 表达时，制造这样的连接，使得5'非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连 结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合 读码框的。可以"有效连接"的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列（即基因 表达元件，例如启动子、5'非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3'非翻译区域、聚腺苷化位 点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特 异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素抗性标记物、 生物合成基因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接 头序列、位点特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序 列、着丝粒序列）。
[0055] 本发明中，所述与生物性胁迫反应相关的蛋白质为HPSl氨基酸序列，如序列表中 SEQIDNO:2所示。所述与生物性胁迫反应相关的基因为HPSl核苷酸序列，如序列表中SEQ IDNO: 1所示。所述与生物性胁迫反应相关的基因，特别是耐盐基因，可用于植物，特别是玉 米和拟南芥转化的DNA序列，除了包含由HPSl核苷酸序列编码的蛋白质的编码区外，也可 包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的 蛋白质的编码区。
[0056] 本发明提供了一种与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途，具有以 下优点：
[0057] 1、首次分离。本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质首次从高粱中克隆获得，并 经过比较分析证明，转基因拟南芥的耐盐能力显著提高，
[0058] 2、耐盐性好。本发明耐盐蛋白质HPSl通过农杆菌介导的方法转入拟南芥，实验证 明，其可以耐受450mM的盐胁迫。
[0059] 3、本发明培育的耐盐植物将会对改良、开发利用盐碱地资源、缓解土地压力、增加 后备耕地储备、保障粮食安全具有重要意义。
[0060] 下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
[0061] 图1为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的含有高粱 cDNA文库片段的重组表达载体DBN-Sb构建流程图；
[0062] 图2为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的高粱文库质 粒中cDNA插入片段的PCR扩增后的电泳图；
[0063] 图3为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的转入HPSl基 因的拟南芥植株在文库初筛时的耐盐效果图；
[0064] 图4为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的转入HPSl基 因的拟南芥植株在初步验证时的耐盐效果图；
[0065] 图5为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的转入HPSl基 因的拟南芥植株在再次验证时的耐盐效果图；
[0066] 图6为本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码基因及用途的转入HPSl基 因的拟南芥植株中外源插入片段的PCR扩增后的电泳图。
【具体实施方式】
[0067] 下面通过具体实施例进一步说明本发明与生物性胁迫反应相关的蛋白质、其编码 基因及用途的技术方案。
[0068] 第一实施例、高粱全长cDNA文库的构建
[0069] 取盐处理过的高粱组织制备其总RNA，然后经过mRNA的分离、脱磷酸基团、脱帽、 连接CAPTag处理后，由纯化的mRNA合成cDNA第一链，进而合成双链DNA，双链DNA经酶 切后通过琼脂糖凝胶电泳进行片段的大小分级，按下述片段大小分别割胶回收：2-12kb， l-2kb，0. 5-lkb，〈0. 5kb。用限制性内切酶BsaI分别酶切割胶回收后的上述片段和表达载 体DBN-BsaI(载体骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供）），将酶切过的上述基因片段 插到表达载体DBN-BsaI的BsaI位点内，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员 所熟知的，构建成重组表达载体DBN-Sb混合物，其构建流程如图1所示（Spe:壮观霉素基 因；RB:右边界；prCaMV35s:花椰菜病毒启动子（SEQIDNO:3);Sb:高粱文库基因；Nos:胭 脂碱合成酶基因的终止子（SEQIDN0:4) ;Bar:草胺膦抗性基因（SEQIDN0:5) ;LB:左边 界）。
[0070] 然后将所述重组表达载体混合物用电击方法转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细 胞，其电击条件为：50yL大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞、IyL文库质粒DNA(重组克隆载 体混合物），在预设程序Ec2 (2. 5kV，6.Oms)下电击转化后，37 °C在LB液体培养基（胰蛋白 胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，用NaOH调pH至7. 5)中振荡培养1小时（200rpm 转速下摇床摇动），在含有壮观霉素（l〇〇mg/L)的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提 取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上生长过夜。挑取白色克隆，对 转化后的重组大肠杆菌用由引物I:ttccaaccacgtcttcaaag(如SEQIDN0:6所不）和引 物2:ggactctaatcataaaaacccatc(如SEQIDN0:7所示）组成的引物对进行PCR鉴定，并 电泳检测cDNA插入片段的大小，计算重组克隆子比例，同时进行cDNA5'末端测序，分析文 库中全长cDNA的比例。获得的高粱文库的库容量为2X106,文库重组率为95 %，全长率为 94. 4%，如图2所示。
[0071] 第二实施例、高粱全长cDNA文库的拟南芥转化
[0072] 1、全长cDNA文库质粒的提取
[0073]刮取上述所有高粱文库菌斑，在500mL含有壮观霉素（100mg/L)的LB液体培养基 中于温度37°C条件下培养30min。分小管碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心 lmin，去上清液，沉淀菌体用IOOyL冰预冷的溶液I(25mMTris_HCl，10mMEDTA(乙二胺四 乙酸），50mM葡萄糖，pH8. 0)悬浮；加入200yL新配制的溶液II(0. 2MNaOH，1 %SDS(十二 烷基硫酸钠）），将管子颠倒5次，混合，置冰上3-5min;加入150yL冰冷的溶液III(3M醋 酸钾，5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心 5min，取适量上清，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混勾后室温放置5min;于温度4°C、 转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干； 每小管加入 30yL含RNase(20yg/mL)的TE(10mMTris-HCl，lmMEDTA，pH8. 0)溶解沉淀； 于温度37°C下水浴30min，消化RNA;于温度-20°C保存备用。
[0074] 2、全长cDNA文库质粒农杆菌转化
[0075] 对已经构建好的高粱全长cDNA文库用电击法转化到农杆菌GV3101中，其转化条 件为：取2yL文库质粒DNA(重组表达载体混合物）与50yL农杆菌GV3101感受态细胞混 匀，冰上静置5min后转移到预冷的电击杯中，在预设程序Ec2 (2. 5kV，6.Oms)下电击转化， 将转化后的农杆菌GV3101接种于LB液体培养基中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养 1小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin)和100mg/L的壮观霉素的LB固体平板上直 至长出阳性单克隆。挑取白色克隆，对转化后的重组农杆菌同样用由所述引物1和所述引 物2组成的引物对进行PCR鉴定，并电泳检测cDNA插