79] 在一个实施方案中分选酶基序是LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸 残基）。
[0180] 在一个实施方案中第一结合结构域或第一结合实体在20个C末端氨基酸残基内 包含或具有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基）。
[0181] 在一个实施方案中细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。在一个实施方案中哺乳动物 细胞选自HEK细胞、CHO细胞，或BHK细胞。
[0182] 在一个实施方案中，Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少 一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第 228、233、234、235、236、237、297、318、320、322 和331位置的氨基酸残基的组，其中？(：区中 的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的（野生型）Fc区相比，这些特定氨基酸残基 的变化导致Fc区的效应子功能改变。
[0183] 在一个实施方案中结合实体选自（或第一结合实体和第二结合实体彼此独立地 选自）基于darpin结构域的结合实体、基于抗运载蛋白（anticalin)结构域的结合实 体、基于T细胞受体片段样scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基 于第十纤连蛋白3结构域的结合实体、基于生腱蛋白结构域的结合实体、基于钙黏着蛋白 结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于 GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构 域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体，或抗体片段如Fab，或scFab，或 scFv片段。
[0184] 在一个实施方案中第一多肽结构域i)在其C末端氨基酸序列区中（即20个C末 端氨基酸残基内）包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基） 和ii)在其C末端处包含内质网驻留信号KDEL(SEQ ID N0:02)，并且第二多肽结构域在其 N末端处包含寡甘氨酸Gm(m= 2,或3,或4,或5)。
[0185] 在一个实施方案中第二多肽结构域或第二结合实体在其N末端处包含寡甘氨酸 Gm(m = 2,或3,或4,或5)氨基酸序列。
[0186] 在一个实施方案中，人抗体Fc区是人IgGl亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3 亚类的，或人IgG4亚类的。
[0187] 在一个实施方案中，抗体Fc区是人IgGl亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
[0188] 在一个实施方案中，人抗体Fc区包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322、329和/或331中一个处天然存在氨基酸残基向不同残基的突 变，其中抗体Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
[0189] 在一个实施方案中，人抗体Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变 和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包 含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中 Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的（野生型）Fc区相比，这些特定氨基 酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
[0190] 在一个实施方案中，与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区针对 人FcyRIIIA、和/或FcyRIIA和/或FcyRI具有减低的亲和力。
[0191] 在一个实施方案中，人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨 酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
[0192] 在一个实施方案中，人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种： S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G 和 / 或 P331S。
[0193] 在一个实施方案中，如果抗体Fc区是人IgGl亚类，则突变是L234A和L235A，或如 果抗体Fc区是人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
[0194] 在一个实施方案中，抗体Fc区包含突变P329G。
[0195] 在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第 二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
[0196] 在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第 二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
[0197] 在一个实施方案中，除第329位置处的氨基酸残基脯氨酸突变之外，抗体Fc区在 Fc区中包含与增加的抗体Fc区缀合物稳定性相关的至少一个其他氨基酸残基添加、突变 或缺失。
[0198] 在一个实施方案中，如果Fe区属于IgG4亚类，则Fe区中的其他氨基酸残基添加、 突变或缺失在Fe区的第228和/或235位置处。在一个实施方案中，第228位置处的氨基 酸残基丝氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸由另一种氨基酸置换。在一个实施 方案中，抗体Fe区缀合物在第228位置处包含脯氨酸残基（丝氨酸残基至脯氨酸残基的突 变）。在一个实施方案中，抗体Fe区缀合物在第235位置处包含谷氨酸残基（亮氨酸残基 至谷氨酸残基的突变）。
[0199] 在一个实施方案中，Fe区包含三个氨基酸突变。在一个实施方案中，这三个氨基 酸突变是 P329G、S228P 和 L235E 突变（P329G SPLE)。·
[0200] 在一个实施方案中，如果Fe区属于IgGl亚类，则Fe区中的其他氨基酸残基添加、 突变或缺失在Fe区的第234和/或235位置处。在一个实施方案中，第234位置处的氨基 酸残基亮氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸突变成另一种氨基酸。
[0201] 在一个实施方案中，Fe区在第234位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残 基突变成丙氨酸氨基酸残基。
[0202] 在一个实施方案中，Fe区在第235位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残 基突变成丙氨酸氨基酸残基。
[0203] 在一个实施方案中，Fe区包含在第329位置处的氨基酸突变，其中脯氨酸氨基酸 残基突变成甘氨酸氨基酸残基、在第234位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突 变成丙氨酸氨基酸残基，和在第235位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成 丙氨酸氨基酸残基。
[0204] 具有对FcRn增加的亲和力的Fe区变体具有较长血清半寿期，并且这类分子将在 治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中需要所施用的抗体或Fe区缀合物的长久全身 性半寿期，例如，以治疗慢性疾病或病症。
[0205] 具有降低的FcRn结合亲和力的抗体Fe区缀合物具有较短血清半寿期，并且这类 分子将在治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中期望所施用的抗体Fe区缀合物的较 短全身性半寿期，例如，以避免毒性副作用或用于体内诊断性成像应用。具有降低的FcRn 结合亲和力的Fe区融合多肽或缀合物较不可能穿过胎盘，并且因此可以用于治疗怀孕女 性中的疾病或病症。
[0206] 在一个实施方案中，具有对FcRn改变的结合亲和力的Fe区是在以下一个多个 氨基酸位置具有氨基酸改变的 Fe 区：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、 305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、 424、433、434、435、436、439 和 / 或 447。
[0207] 在一个实施方案中，该Fe区是在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、 388、400、415、433、435、436、439和/或447具有一个或多个氨基酸改变的Fe区。
[0208] 在一个实施方案中，显示增加的对FcRn的结合的Fe区在氨基酸位置238、256、 265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和 /或434包含一个或多个氨基酸改变。
[0209] 在一个实施方案中，Fe区是IgGl亚类的Fe区并且包含氨基酸突变P329G和/或 L234A 和 L235A。
[0210] 在一个实施方案中，Fe区是IgG4亚类的Fe区并且包含氨基酸突变P329G和/或 S228P 和 L235E。
[0211] 在一个实施方案中抗体Fe区在第一重链Fe区多肽中包含突变T366W并在第二重 链Fe区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
[0212] 在一个实施方案中抗体Fe区在第一重链Fe区多肽中包含突变S354C并在第二重 链Fe区多肽中包含突变Y349C。
[0213] 伸用分诜酶A的酶促缀合
[0214] 可以通过使用分选酶A在体内获得多结构域多肽。
[0215] 许多革兰氏阳性细菌使用分选酶以将多种表面蛋白（包括毒力因子）共价 地锚定至它们的细胞壁（肽聚糖）上。分选酶是膜结合酶。野生型金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)分选酶A(SrtA)是具有N末端跨膜区的206个氨基酸的多肽。 在第一步骤中，分选酶A识别含有LPXTG(SEQ ID N0:01)氨基酸序列基序的底物蛋白并且 借助活性位点Cys切割Thr和Gly之间的酰胺键。这种肽切割反应产生分选酶A-底物硫 酯中间体。在第二步骤中，通过亲核性攻击含有寡甘氨酸的第二底物多肽（对应于金黄色 葡萄球菌中肽聚糖的五甘氨酸单元）的氨基，消除硫酯酰基-酶中间体，导致共价连接的细 胞壁蛋白和分选酶A再生。在不存在寡甘氨酸亲核体的情况下，酰基-酶中间体可以由水 分子水解。
[0216] 分选酶介导的连接/缀合已经开始用于多种蛋白质工程和生物缀合目 的。这种新技术能够将天然和合成的官能团引入加 LPXTG标签的重组或化学合成的 多肽。例子包括共价接合寡甘氨酸衍生化聚合物（例如PEG)、荧光团、维生素（例 如生物素和叶酸）、脂质、糖、核酸、合成肽和蛋白质（例如GFP) (Tsukiji，S.和 Nagamune，T.，ChemBioChem 10 (2009) 787-798 ;Popp，M. W. -L.和 Ploegh，H. L.，Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032)。
[0217] 已经显示氨基组分的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足够用于SrtA介导的连接步 骤（Clancy, K.W·等人，P印tide Science 94(2010)385-396)。
[0218] 为了酶促缀合，可以使用缺少跨膜区的可溶性截短分选酶A(SrtA;金黄 色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206) (Ton-That, H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96(1999) 12424-12429;Ilangovan，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)6056-6061)。
[0219] 至少在其N末端之一包含寡甘氨酸基序（Gm，m = 2、或3、或4、或5)的任何多肽 结构域可以从真核细胞（例如HEK293细胞、CHO细胞）表达并且从其上清液纯化。
[0220] 在一条