多肽链的C末端包含SrtA识别基序的结合实体（例如单链抗原结合多 肽如scFv、scFab或darpin，或多链抗原结合多肽如dsFv或Fab)可以从真核细胞（例如 HEK293细胞、CHO细胞）表达并且从其上清液纯化。
[0221] "Combimatrix" 方案
[0222] 理想的是将第一结合实体如抗体Fab片段与另一种特异性结合实体如包含全长 重链及其同族全长轻链和二硫键连接的重链Fe区多肽的第二抗体Fab片段或单臂抗体片 段组合。此外当第一结合实体与许多不同其他结合实体连接时，可以筛选第一结合实体是 否显示更好的特性。使用所谓的Combimatrix方案，可以用便利方式确定结合实体的多种 组合。应当指出第二结合实体可以与不同靶/表位/抗原结合，或可以与相同抗原结合但 是结合至不同表位，或可以与相同表位结合，不过是单一结合实体的不同变体（例如人源 化候选物）。
[0223] 在这种情况下，可以实施自动化平台方法。使用例如96孔板或其他高通量模式的 任何平台是合适的，如Eppendorf epMotion 5075vac移液机器人。
[0224] 首先，进行编码结合实体的构建体的克隆。通常通过基因合成或PCR扩增获得带 有编码结合实体的核酸的质粒，以此一个被编码的结合实体的C末端区含有分选酶基序， 和内质网驻留信号，并且各个其他结合实体的N末端区包含N末端寡甘氨酸基序，其包含 或是至少两个连续的甘氨酸残基（二甘氨酸）。将质粒各自转移至多孔板的分开的板孔中 (可以加载整块平板）。此后，质粒用切下结合实体编码区的限制性酶混合物消化。理想的 是以全部质粒仅需要一种限制性酶混合物的方式设计全部基因合成和/或PCR引物。此后， 任选的清洁步骤产生纯化的DNA片段。将这些片段连接至已经用与如上文提到的相同的限 制性酶混合切去受体载体的质粒骨架中。备选地，克隆流程可以由SLIC介导的克隆步骤执 行。在连接后，自动化平台将全部连接混合物转移至另外的具有感受态大肠杆菌细胞的多 孔板（例如ToplOMulti Shot，Invitrogen)，并且进行转化反应。将细胞培育至所需的密 度。从培养混合物的等分试样可以获得甘油贮藏物。从培养物分离质粒（例如使用质粒分 离微量试剂盒（例如NucleoSpin 96 Plasmid，Macherey& Nagel))。通过用适宜的限制酶 混合物消化等分试样和SDS凝胶电泳（例如E-Gel 48, Invitrogen)验证质粒身份。此后， 新平板可以用质粒的等分试样加载以进行对照测序反应。
[0225] 在下一个步骤中表达结合实体。为此，将HEK细胞接种到多孔板（例如48孔-平 板）上并且用各个分离的质粒组合（在适宜的骨架载体中含有结合实体编码区）连同编码 具有C末端内质驻留信号的可溶分选酶的质粒转染。因此，用三种表达质粒共转染HEK细 胞：i)编码具有C末端His标签，分选酶基序和内质驻留信号（以N末端至C末端方向）的 结合实体的质粒，ii)编码具有至少两个甘氨酸残基的N末端寡甘氨酸基序的结合实体的 质粒和iii)编码具有C末端内质驻留信号的可溶分选酶的质粒。将转染的HEK细胞培育 几日并随后收获培养物上清（例如通过使用真空工作站经1. 2 μ m和0. 22 μ m滤板过滤）。 可以通过实施例如ELISA监测滴度。
[0226] 在体内表达期间利用分选酶介导的转肽反应，结合实体可以彼此连接。这是因为 包含C末端分选酶识别基序的结合结构域包含内质网驻留信号而实现的。采用的可溶分选 酶在其C末端包含相同的内质网驻留信号。因此，这两个分子均几乎全部驻留在内质网中。 当第二多肽结构域进入内质网中时，发生酶促缀合反应，并且将缺乏内质网驻留信号（在 酶促转肽反应过程中被移除）的酶促缀合物分泌到培养基中。可以通过使用HiS标签选择 程序收获缀合物（将培养物上清施加到例如His MultiTrap HP板（GE Healthcare)上并 过滤，以此包含His标签的全部分子结合在基质上（即缀合物）并可以在用适当的洗脱缓 冲液洗涤后洗脱，而全部其他分子将不结合层析材料。
[0227] 可以使用Combimatrix方案产生多特异性结合分子，参见下表。
[0228]
【主权项】
1. 生产包含至少两个多肤结构域的多肤的方法，所述方法包括步骤为 -培养细胞，所述细胞包含 a) 编码具有C末端内质网驻留信号的可溶金黄色葡萄球菌分选酶A的核酸， b) 编码在其C末端处包含后接内质网驻留信号的分选酶基序的第一多肤结构域的核 酸，和 C)编码在其N末端处至少包含二甘氨酸的第二多肤结构域的核酸， 由此细胞分泌第一多肤结构域和第二多肤结构域的分选酶A缀合物， 从而生产包含至少两个多肤结构域的多肤。
2. 生产包含至少两个结合实体的多特异性结合物的方法，所述方法包括步骤为 -培养细胞，所述细胞包含 a) 编码具有C末端内质网驻留信号的可溶金黄色葡萄球菌分选酶A的核酸， b) 编码在其C末端处包含后接内质网驻留信号的分选酶基序的第一结合实体的核酸， 和 C)编码在其N末端处至少包含二甘氨酸的第二结合实体的核酸， 由此细胞分泌第一结合实体和第二结合实体的分选酶A缀合物， W此第一结合实体特异性结合第一抗原或祀并且第二结合实体特异性结合第二抗原 或祀， 从而生产包含至少两个结合实体的多特异性结合物。
3. 选择特异性结合两种不同表位或抗原的多特异性结合物的方法，所述方法包括步骤 为 -从包含第一结合实体和第二结合实体的不同组合的多种多特异性结合物中选择特异 性结合两种不同表位或抗原的多特异性结合物， 其中多种多特异性结合物的成员每者是通过根据权利要求2的方法获得的。
4. 根据权利要求3的方法，其特征在于多特异性结合物是基于其结合特异性和/或选 择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期选择的。
5. 根据权利要求2至4中任一项的方法，其特征在于结合实体是抗体重链可变结构域 和抗体轻链可变结构域的同族对。
6. 根据权利要求2至4中任一项的方法，其特征在于多特异性结合物是包含两个或四 个结合实体的双特异性抗体。
7. 根据权利要求1的方法，其特征在于第一多肤结构域和第二多肤结构域彼此独立地 选自全长抗体、scFv、scF油、抗体重链、抗体轻链、抗体重链化区片段、抗体轻链可变结构 域和抗体重链可变结构域对、VH、VL、CH1、C肥、C册、CH4、化、抗体较链区、细胞因子、受体、 受体配体、可检测的标签、标记，和结合对的伙伴。
8. 根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于内质网驻留信号选自SEQ ID 側：02(邸化）、569 10側：03(皿化）、或569 10側：04 6。1《《《《]\^)。
9. 根据权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于分选酶基序是LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸残基）。
10. 根据权利要求1至9中任一项的方法，其特征在于第一结合结构域或第一结合实体 在20个C末端氨基酸残基内具有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨 基酸残基）。
11. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于细胞是哺乳动物细胞或酵母细 胞。
12. 根据权利要求11的方法，其特征在于哺乳动物细胞选自肥K细胞、C册细胞、或BHK 细胞。
13. 选择双特异性抗体的方法，所述方法包括W下步骤 (i) 测定含有细胞的样品中存在的细胞表面标志物并至少选择其中第一表面标志物和 第二表面标志物， (ii) 用W下转染细胞；(a)核酸，其编码在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸残基）、后接内质网驻留信号K呢L(SEQ ID N0:02)的抗体F油片段，或抗体scF油，或scFv抗体，W此F油片段或scFv抗体特异性结 合第一表面标志物或其配体，（b)核酸，其编码包含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重 链化区多肤的单臂抗体片段，W此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体 链并且其可变结构域对（VH和VL)形成与第二表面标记物或其配体特异性结合的抗原结合 位点，W此全长抗体重链和抗体重链化区多肤通过形成抗体较链区的一个或多个二硫键 彼此共价连接，并且W此抗体重链化区多肤在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、 或5)氨基酸序列，和（C)编码具有C末端内质网驻留信号的可溶金黄色葡萄球菌分选酶A 的核酸， 并从而生产双特异性抗体。
14. 测定抗原结合位点的组合的方法，所述方法包括W下步骤 (i) 确定通过如下方式制备的多种双特异性抗体的结合特异性和/或选择性和/或亲 和力和/或效应子功能和/或体内半寿期：组合（a)第一多种抗体Fab片段或scFv抗体片 段的每个成员，W此每个成员在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可W是任何氨基酸残基）、后接内质网驻留信号邸化(SEQ ID N0:02)，W此 F油片段或scFv抗体与第一表位或抗原特异性结合，与（b)多种包含全长抗体重链、全长 抗体轻链和抗体重链化区多肤的单臂抗体片段的每个成员，W此全长抗体重链和全长抗 体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对（VH和VL)形成与第二表位或抗原特 异性结合的抗原结合位点，W此全长抗体重链和抗体重链化区多肤通过形成抗体较链区 的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且W此抗体重链化区多肤在其N末端具有寡甘氨酸 Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，经由金黄色葡萄球菌分选酶A介导的胞内酶促偶联 反应， 和 (ii) 选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和/或 体内半寿期的双特异性抗体并且因而确定抗原结合位点的组合。
15. 通过根据权利要求6至13中任一项的方法获得的双特异性抗体。
16. 双特异性抗体，其在其重链之一中包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可 W是任何氨基酸残基）。
17. 根据权利要求6至13中任一项的方法或根据权利要求15或16中任一项的抗体，其 特征在于化区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向 不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中化区中的残基根据K油at 的抓索引编号。
18. 药物制剂，其包含根据权利要求15或权利要求16或权利要求17的双特异性抗体。
19. 根据权利要求15或权利要求16或权利要求17的双特异性抗体在制备药物中的用 途。
【专利摘要】本文报道了生产包含至少两个多肽结构域的多肽的方法，所述方法包括步骤为培养细胞，所述细胞包含(a)编码具有C末端内质网驻留信号的可溶金黄色葡萄球菌分选酶A的核酸，(b)编码在其C末端处包含后接内质网驻留信号的分选酶基序的第一多肽结构域的核酸，和(c)编码在其N末端处至少包含二甘氨酸的第二多肽结构域的核酸，由此细胞分泌第一多肽结构域和第二多肽结构域的分选酶A缀合物，从而生产包含至少两个多肽结构域的多肽。
【IPC分类】C07K1-107
【公开号】CN104619715
【申请号】CN201380047702
【发明人】M·贝克, G·蒂芬塔勒
【申请人】弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年9月12日
【公告号】CA2879499A1, EP2895496A1, WO2014041072A1