一株高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于微生物领域，涉及乳酸菌。
【背景技术】
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[0002]随着化石能源的短缺和白色污染的日益严重，生物基高分子材料越来越引起重视。聚乳酸即为一种可以部分替代化石级塑料的重要可降解生物基高分子材料。它是以乳酸为单体合成的高分子聚合物，具有非常广阔的应用前景，目前国际国内已经有众多科研机构和公司利用聚乳酸开发出可降解塑料薄膜、餐盒、杯子、手术缝合线、光盘、计算机壳等多种产品。
[0003]但是由于乳酸的生产成本居高不下，聚乳酸的大量应用受到严重限制。乳酸生产成本中一大部分在于其碳源成本，目前生产乳酸的碳源主要是采用玉米淀粉、木薯淀粉等粮食原料，即便是采用农业废弃物中的淀粉质原料，其生产成本仍然不能与化石基塑料相匹敌。
[0004]而玉米秸杆、稻草和木屑等纤维素基废弃物相比而言其价格则可大大降低。但目前的主要瓶颈在于绝大多数乳酸菌只能利用这些原料中的六碳糖，而五碳糖几乎完全不能利用。发酵液中大量五碳糖的残留既导致资源的浪费，也给发酵废弃物的处理带来一定压力。因此，五碳糖代谢菌的发掘对于聚乳酸的大规模应用具有重要的意义。
【发明内容】
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[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一株能够高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌菌株。
[0006]本发明所提供的乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)L1-2013_01，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7928，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2013年7月15日。该菌株特点如下:在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。理化特征为:过氧化氢酶(_)，明胶液化(_)，吲哚实验( + )，运动性(_)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.5MRS培养基中生长(+ )。
[0007]本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育:
[0008]原始出发菌种一试管活化一硫酸二乙酯(DES)诱变一平板初筛一亚硝基胍(NTG)诱变一平板初筛一摇瓶复筛一传代稳定性试验。
[0009]原始出发菌种为CICC20242，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0010]本发明所采用的原始菌株在木聚糖培养基中，乳酸的产量为12.5g/L。为了提高其乳酸产量，依次采用DES和NTG对该菌种进行诱变，诱变采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
[0011]菌株CGMCCN0.7928遗传稳定性结果表明:经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCCN0.7928作为选育得到的目的菌株。
[0012]将目的菌株CGMCCN0.7928做1L发酵罐实验，结果表明:发酵72h后，以木聚糖为碳源，植物乳杆菌CGMCCN0.7928的乳酸浓度可以达到57g/L，与出发菌株相比提高了 356%。
[0013]将目的菌株CGMCCN0.7928做1L发酵罐实验，结果表明:发酵72h后，以葡萄糖为碳源，植物乳杆菌CGMCCN0.7928的乳酸浓度可以达到68g/L。
[0014]所述发酵罐培养基组成为:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至6L，调节pH7.0-7.2。
[0015]具体过程如下:
[0016]培养基:
[0017]液体MRS木聚糖培养基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g，逐一溶解后，自来水定容100mL,调节pH7.0-7.2) ；MRS木聚糖筛选固体培养基(牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖90g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g,逐一溶解后，自来水定容100mL,调节pH7.0-7.2，加入20g琼脂)；
[0018]1.硫酸二乙酯(DES)诱变选育
[0019]I)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0020]2)取5mL菌液，5000rpm离心1min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0021]3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0022]4)取32mLpH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mLDES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1% (v/v)0
[0023]5)在 30°C摇床中 150rpm 反应 30min，取 ImL 混合液，加入 0.5mL25%Na2S203 溶液中止反应。
[0024]6)稀释涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖筛选固体培养基平皿中。在40°C培养2?3天后挑取透明圈/菌落直径最大的菌株，标号为DES菌。
[0025]2.亚硝基胍诱变
[0026]I)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌DES—环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40°C培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
[0027]2)取5mL菌液5000rpm离心1min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0028]3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
[0029]4)取1mL菌悬液转移至10mL三角瓶中，加入1mg的NTG，配制成终浓度为1mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0030]5)在30°C下200rpm振荡反应30min, 5000rpm离心1min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
[0031]6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖筛选固体培养基平皿中。在40°C培养2?3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株150支。
[0032]3.摇瓶复筛
[0033]I)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm, 40°C培养3_4天，每天检测木聚糖浓度和L-乳酸浓度变化。发酵结束后，比较150株菌种的木聚糖消耗速率和乳酸产生速率、乳酸的转化率以及杂酸含量。
[0034]2)选择木聚糖代谢速率快、乳酸浓度高、转化率高以及杂酸含量少的菌种为最终菌种，命名为Li菌。
[0035]4.遗传稳定性试验
[0036]将L1-2013-01菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
[0037]有益效果:
[0038]该菌株可高效利用各种生物质原料，不仅可利用常见的淀粉质原料、单糖、双糖、六碳糖等，且可利用五碳糖，代谢速率快，产乳酸浓度高，转化率高，杂酸含量少。以木聚糖为碳源，发酵72h后，乳酸浓度可以达到57g/L，与出发菌株相比提高了 356%。菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。结果发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
【具体实施方式】
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[0039]实施例1
[0040]将该菌株CGMCCN0.7928做1L发酵罐实验，以蔗糖为碳源，结果表明:发酵72h后，乳酸浓度可以达到60g/L。
[0041]发酵罐培养基为:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、蔗糖120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至 6L，调节 ρΗ7.0-7.2。
[0042]实施例2
[0043]将该菌株CGMCCN0.7928做1L发酵罐实验，以来苏糖为碳源，结果表明:发酵72h后，乳酸浓度可以达到54g/L。
[0044]发酵罐培养基为:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、来苏糖120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至 6L，调节 ρΗ7.0-7.2。
[0045]实施例3
[0046]将该菌株CGMCCN0.7928做1L发酵罐实验，以阿拉伯糖为碳源，结果表明:发酵72h后，乳酸浓度可以达到52g/L。
[0047]发酵罐培养基为:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、阿拉伯糖120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至6L，调节pH7.0-7.2。
【主权项】
1.一株高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) L1-2013-01，保藏编号为 CGMCCN0.7928。
2.根据权利要求1所述高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌可发酵利用五碳糖。
3.根据权利要求1所述高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，其特征在于，以木聚糖为碳源，发酵72h后，乳酸浓度可以达到57g/L。
4.根据权利要求1所述高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，其特征在于，以葡萄糖为碳源，发酵72h后，乳酸浓度可以达到68g/L。
5.根据权利要求2-4任一权利要求所述高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌，其特征在于，发酵罐培养基组成为:牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至6L，调节pH7.0-7.2。
6.根据权利要求1所述高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌在发酵生产乳酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株高效利用生物质原料高产乳酸的新型植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Li-2013-01，保藏编号为CGMCC No.7928。其发酵罐培养基组成为：牛肉膏12g、蛋白胨60g、酵母膏30g、碳源120g、乙酸钠30g、柠檬酸铵12g、磷酸氢二钾12g、七水硫酸镁1.2g、七水硫酸锰0.3g，逐一溶解后，自来水定容至6L，调节pH7.0-7.2。该菌株可高效利用各种生物质原料，不仅可利用常见的淀粉质原料、单糖、双糖、六碳糖等，且可利用五碳糖，代谢速率快，产乳酸浓度高，转化率高，杂酸含量少，遗传稳定性较强。CGMCC No792820130715
【IPC分类】C12R1-25, C12P7-56, C12N1-20
【公开号】CN104673691
【申请号】CN201310625005
【发明人】田岗, 李绩, 李政, 苏俊
【申请人】田岗
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月29日