利用展示纤维素酶的酿酒酵母菌群发酵生产乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物工程领域，具体地说，涉及一种利用展示纤维素酶的酿酒酵母 菌群发酵纤维素生产己醇的方法。
【背景技术】
[0002] W纤维素为原料生产燃料己醇具有重要的经济和社会价值，然而，纤维素酶的昂 贵成本W及在纤维素水解、发酵过程中存在的技术瓶颈严重阻碍了燃料己醇的发展进程。 己醇工业化生产的理想途径是利用一种微生物在一种反应器中完成纤维素酶生产、纤维素 水解W及己醇发酵，即统合生物加工过程（Consolidated Bioprocessing, CBF0。由于酿酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)具有较高的己醇产率和较高的己醇耐受性，从而成为理 想的CBP宿主，但它不能直接利用纤维素类物质。大量研究致力于在S. cerevisiae细胞表 面展示纤维素酶W赋予其降解纤维素的能力，并成功构建了一些功能性的全细胞催化剂。 但目前报道的重组酵母菌株并未能取得理想的效果，生产成本并未有效降低，性能良好的 酵母菌株构建及应用仍旧是个亟待解决的难题。
[0003] S. cerevisiae Y5是近年来筛选到的具有良好己醇发酵性能的二倍体絮凝菌株。 其己醇生产的优势在于；絮凝性使得酵母在发酵过程中能更容易分离；相对于实验室菌株 而言，二倍体酵母具有更高的细胞生长速率W及较高的抑制剂耐受性，更有利于工业化己 醇生产。在前期的研究中，我们报道了基于S. cerevisiae Y5构建a-凝集素展示系统及 目-葡糖巧酶1的固定化。重组菌株能有效表达BGLI，同时能在W纤维二糖为唯一碳源的 培养基中生长。然而，纤维素的完全降解至少需要在EG、CBH和B化的协同作用下完成。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种利用展示纤维素酶 (内切葡聚糖酶II、纤维二糖水解酶IIW及目-葡糖巧酶I)的酿酒酵母菌群发酵纤维素生 产己醇的方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种酿酒酵母混合菌群，所述混合菌群包 含展示有内切葡聚糖酶II (EGII)的酿酒酵母重组菌Y5/EGII、展示有纤维二糖水解酶II (CBHII)的酿酒酵母重组菌Y5/CBHII W及展示有目-葡糖巧酶I (B化I)的酿酒酵母重组 菌Y5/B化I。
[0006] 其中，所述内切葡聚糖酶II和纤维二糖水解酶II来自丝状真菌里氏木霉 (Trichoderma reesei),所述目-葡糖巧酶 I 来自棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)。
[0007] 本发明还提供所述酿酒酵母混合菌群的制备方法，W酿酒酵母Y5为受体，利用a 凝集素作为销定蛋白，分别将内切葡聚糖酶II、纤维二糖水解酶II W及目-葡糖巧酶I展 示在酿酒酵母Y5的表面，将构建得到重组菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI按一定比例混 合即得。通过调控H种重组菌之间的混合比例来实现纤维素酶间协同作用的优化。
[0008] 所述重组菌的构建包括如下步骤：
[0009] 1)纤维素酶基因的扩增：所述纤维素酶基因包括内切葡聚糖酶II基因、纤维二糖 水解酶II基因W及目-葡糖巧酶I基因；
[0010] 2)展示载体的构建；W pYDl作为出发载体，分别构建整合有内切葡聚糖酶II基 因、纤维二糖水解酶II基因W及目-葡糖巧酶I基因的展示载体；
[0011] 3)酿酒酵母的转化：整合载体pAGAl经线性化，分别与步骤2)构建得到的展示载 体(例如，通过醋酸裡转化法）共转化至酿酒酵母Y5中构建相应的重组菌。
[0012] 本发明还提供利用所述酿酒酵母混合菌群降解纤维素发酵生产己醇的方法。
[0013] 其中，混合菌群W无定形纤维素（PASC)为唯一碳源进行纤维素生物降解，发酵生 产己醇。
[0014] 优选地，重组菌 Y5/EGII、Y5/CBHn 和 Y5/BGLI 经 YPG 诱导 4她后，按 1-2:1-2:1 的初始接种细胞湿重比混合。
[0015] 更优选地，重组菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI按2:1:1的初始接种细胞湿重比 混合。
[0016] 本发明还提供了所述酿酒酵母混合菌群在纤维素统合生物加工中的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[001引本发明基于酵母a -凝集素销定技术，将T. reesei的EGII和CBHII W及 A. aculeatus的BGLI分别展示在S. cerevisiae Y5表面，构建新型的酵母混合菌群系统，并 利用该菌群系统W无定形纤维素（PASC)为底物进行己醇发酵生产。通过进一步优化系统 中展示不同酶组分的重组菌的比例W期提高纤维素的降解效率，进而提高己醇产率。
【附图说明】
[001引图1为本发明克隆得到的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，A为bgll 基因，B为egl2基因，C为cbh2基因，D为MAT终止子，E为ADH启动子及kanr编码区，F为 ADH终止子，分子量标准为D2000。
[0020] 图2为本发明重组质粒的酶切鉴定结果；其中，A为Not I单酶切地GL，B为Apa I 单酶切祀GII (邸NA)，C 为 EcoR I/Apa I 双酶切 pCBHII (邸NA)。
[0021] 图3为本发明中涉及的展示载体的构建示意图。
[0022] 图4为本发明重组菌株的PCR鉴定结果；其中，A中泳道1-4分别为Y5、Y5/ EGII、Y5/CBHII、Y5/BGL1 基因组 PCR 鉴定结果（2790bp) ;B 中泳道 1-3 分别为 Y5、Y5/EGII (1194bp)、Y5/CBHII (1344bp)质粒PCR鉴定结果；C中泳道1为Y5/B化1 (252化P)质粒 PCR鉴定结果。
[0023] 图5为本发明不同酵母菌群在发酵过程中纤维素酶活性稳定性分析结果。
[0024] 图6为本发明不同酵母菌群W PASC为唯一碳源的己醇发酵结果；其中，A为总糖 浓度，B为己醇浓度；重组菌Y5/EGII、Y5/CBHn和Y5/BGLI的初始接种细胞湿重比依次为 和 1:2:1。
【具体实施方式】
[0025] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a 1油oratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0026] W下实施例中涉及的材料及试剂如下：
[0027] 1、菌株和质粒
[0028] S.cerevisiae Y5(参见化200810222897. 7,保藏编号；CGMCC No. 260)作为纤维 素酶展示的宿主菌；Escherichia coli ToplO购自天根生化科技有限公司；T.reesei及 A. aculeatus购自中国工业微生物菌种保藏管理中也（CICC)，作为纤维素酶基因的来源。
[0029] 酵母表面展示载体pYDl购自Invitrogen ;酵母整合载体YIP5-KanR购自美国 ATCC菌种保藏中也，本发明相关展示载体及重组菌的特性见表1。
[0030] 表1重组菌及展示载体特征
[0031]
【主权项】
1. 一种酿酒酵母混合菌群，其特征在于，所述混合菌群包含展示有内切葡聚糖酶II的 酿酒酵母重组菌Y5/EGII、展示有纤维二糖水解酶II的酿酒酵母重组菌Y5/CBHII以及展示 有@ -葡糖苷酶I的酿酒酵母重组菌Y5/BGLI。
2. 根据权利要求1所述的混合菌群，其特征在于，所述内切葡聚糖酶II和纤维二 糖水解酶II来自里氏木霉（Trichoderma reesei)，所述葡糖苷酶I来自棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)。
3. 权利要求1或2所述混合菌群的制备方法，其特征在于，以酿酒酵母Y5为受体，利用 a凝集素作为锚定蛋白，分别将内切葡聚糖酶II、纤维二糖水解酶II以及葡糖苷酶I 展示在酿酒酵母Y5的表面，将构建得到重组菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按一定比例 混合即得。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重组菌的构建包括如下步骤： 1) 纤维素酶基因的扩增：所述纤维素酶基因包括内切葡聚糖酶II基因、纤维二糖水解 酶II基因以及葡糖苷酶I基因； 2) 展示载体的构建：以pYDl作为出发载体，分别构建整合有内切葡聚糖酶II基因、纤 维二糖水解酶II基因以及0 -葡糖苷酶I基因的展示载体； 3) 酿酒酵母的转化：整合载体pAGAl经线性化，分别与步骤2)构建得到的展示载体共 转化至酿酒酵母Y5中构建相应的重组菌。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中通过醋酸锂转化法将整合 载体与展示载体共转化至酿酒酵母Y5中。
6. 利用权利要求1或2所述的混合菌群降解纤维素发酵生产乙醇的方法。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，混合菌群以无定形纤维素为唯一碳源进 行纤维素生物降解，发酵生产乙醇。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，重组菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI经 YPG诱导48h后，按1-2:1-2:1的初始接种细胞湿重比混合。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，重组菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按 2:1:1的初始接种细胞湿重比混合。
10. 权利要求1或2所述的混合菌群在纤维素统合生物加工中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种表面展示纤维素酶类的酿酒酵母Y5菌群，实现以PACS为底物进行纤维素乙醇统合加工的方法。该菌群可通过灵活调控与优化其各组分间（分别单展示内切葡聚糖酶II、纤维二糖水解酶II和β-葡糖苷酶I的酵母组分）的比例，提高其纤维素降解能力，提升乙醇产量。此外，二倍体工业酿酒酵母Y5具有较强的抑制剂耐受性、高浓度乙醇耐受性及自絮凝等优良特性，以其作为出发菌种所构建的表面展示复合菌群更适用于纤维素乙醇的工业化生产。
【IPC分类】C12P7-10, C12R1-865, C12N1-19
【公开号】CN104673689
【申请号】CN201310618222
【发明人】田沈, 杨秀山
【申请人】首都师范大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月27日