一种检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。
【背景技术】
[0002]烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研宄的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。国际烟草科学研宄合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，推荐了传统卷烟的烟气毒理学检测方法。但是口含烟制品的使用方式与传统卷烟吸入式不同，口含烟制品直接经口使用，且其溶出物会随唾液进入消化系统，使用过程中不产生烟气，其暴露途径显著有别于传统卷烟，传统卷烟的细胞毒性检测方法可能不适用于口含烟。目前国内外研宄机构及烟草公司尚未制定统一的标准检测方法用于口含烟制品的细胞毒性检测。
[0003]对于卷烟细胞毒性的检测，目前通常采用中性红细胞毒性法，但存在一定的缺陷。中性红进入细胞并在细胞内聚集的过程要求有完整的细胞膜，而细胞凋亡早期细胞膜表面发生改变，带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。这种改变可能会影响中性红细胞毒性法的检测结果。细胞凋亡的概念是1972年由 Kerr 等三位科学家首次提出(Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basicb1logical phenomenon with wide-ranging implicat1ns in tissue kinetics.Br J ancer, 1972, 26:239 - 257.)，虽然细胞凋亡(apoptosis)与细胞坏死(necrosis)的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。因此，有必要开发一种用于检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的方法，作为口含烟细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞坏死和凋亡的影响。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是针对上述技术问题，对口含烟制品细胞早期凋亡影响的流式检测法进行了综合研宄，确定了口含烟制品的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的流式检测法。
[0005]本发明通过下列技术方案实现:一种检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的方法，经过下列各步骤:
(1)样品前处理:
准确称取1.0g 口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37°C下恒温水浴中静置24h后再进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45 μ m有机滤膜过滤除菌，得到待测液；
(2)单细胞悬液的制备: 人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37°C、5%C02、95%RH(空气相对湿度)培养箱中培养，待细胞汇合率为80?90%时移除培养箱，再用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液，然后加入I?2mL浓度为0.25% (w/v)的胰蛋白酶溶液进行单层孵育I?2min，加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算:
用血球计数板计数法对步骤(2)所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)细胞接种:
将步骤(3)计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0X 15个/mL，再按接种量为2mL/孔，接种到6孔细胞培养板中，将6孔细胞培养板置于37°C、5%C02培养箱内培养24h ；
(5)分组设定:分为细胞对照组和样品组，其中细胞对照组加入DMEM/F12细胞培养基；样品组加入不同剂量的步骤(I)所得待测液；
(6)剂量设定:
以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量，即:20 μ g/mL、40 μ g/mL、60 μ g/mL、80 μ g/mL ；
(7)加入受试物:
移除步骤(4)中6孔细胞培养板内的培养基，再按步骤(5)进行分组，在对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在样品组相应的孔内加入步骤(I)所得待测液，使终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；对照组和样品组的终体积为2mL/孔；
(8)孵育受试物:
将步骤(7)加样后的6孔细胞培养板置于37°C、5%C02、95%RH (空气相对湿度)培养箱中孵育24h ；
(9)收集细胞:
收集步骤(8)中的培养液，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后连同收集的培养液，于300g的转速下，4°C离心5min，收集细胞；
(10 )用预冷的PBS洗涤步骤(9 )所得细胞2次，每次均于300g转速下，4°C离心5min，收集细胞，再加入100 μ L的Binding Buffer重悬细胞，加入5 μ L的Annexin V-FITC和5 μ L的PI染料，轻轻混勾，然后在避光、室温下反应lOmin，再加入400 μ L的Binding Buffer进行混匀得到检测样品，在I小时内用流式细胞仪检测，即得到细胞早期凋亡影响率。
[0006]本发明的优点在于:本发明对口含烟制品细胞早期凋亡影响的流式检测法进行了综合研宄，确定了口含烟制品的检测剂量，以及口含烟制品前处理方法，制定了一种适用于检测口含烟制品对细胞早期凋亡影响的流式检测法，可作为口含烟细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞坏死和凋亡的影响。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品对细胞早期凋亡的影响。
【附图说明】
[0007]图1为骆驼(Camel)品牌薄荷口味Snus对细胞早期凋亡率影响的检测结果。
【具体实施方式】
[0008]下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
[0009]实施例1
用于骆驼(Camel)品牌薄荷口味Snus型口含烟制品对细胞早期凋亡率影响的检测。
[0010](I)样品前处理:
准确称取1.0g 口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37°C下恒温水浴中静置24h后再进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45 μ