一种基于双重信号扩增的探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于双重信号扩增的探针及其检 测DNA分子的方法。
【背景技术】
[0002] DNA检测（也称为基因检测）在由病毒引起的传染病的诊断、监测和治疗方面是非 常重要的，例如肝炎病毒、疱瘆病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV)、人乳头状瘤病毒以及与基因 突变相关联的其他疾病。以HIV为例，传统的确定HIV感染的方法是血液检测，例如酶联免 疫吸附试验（ELISA)、酶免疫测定（EIA)和韦斯顿吸墨试验。这些检测方法虽然很灵敏，但 需要很长的时间来产生抗体，因此相当的耗时。有别于血液检测，DNA检测是直接检测病毒 本身而不需要HIV抗体的，因此，一旦病人感染上HIV病毒就可以被实时检测出来。目前， 在DNA检测中，聚合酶链反应（PCR)依然是一个金标准，但是，聚合酶链反应需要蛋白酶和 热循环来触发扩增，因此，具有高成本、耗时长、选择性低、受限于耐热酶和实验室设备等缺 点。
[0003] 脱氧核酶（DNA酶）属于催化核酸的一类物质，通过体外选择被分离出来，具有对 特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性、将DNA功 能和结构信息编入模板序列的灵活性，以及属于核酸低的非特异结合性等优点，是生物应 用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引 起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子一氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA 酶，进而将H 202介导的2, 2' -联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS勹催化氧化成绿 色的ABTS'或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红 素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。
[0004] 例如，中国专利文献CN102827836A公开了一种寡核苷酸探针以及用其对靶分子 进行检测的方法，上述探针为基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA -对发夹序列，实质 是杂交链式反应的发夹序列与G-四链体序列相结合的产物。当反应体系中不存在靶分子 时，两个发夹序列保持亚稳态的发夹结构；当反应体系中存在靶分子时，靶分子便可与第一 个发夹序列特异性结合，破坏其二级结构并释放剩余的G-四链体序列，第一个发夹释放的 自由的G-四链体序列可与第二个发夹序列杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有 相同作用的核酸序列，也可与第一个发夹的靶分子特异性识别部分特异性结合，从而导致 两个发夹级联杂交，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，被释放的大量 自由的G-四链体序列即可与氯化血红素（hemin)结合，催化氧化H 202介导的ABTS，从而检 测靶分子。但是上述探针检测靶分子时，存在背景噪声较大、灵敏度较差的问题。具体而 言，在反应体系中，发夹结构与未形成发夹结构的直链是保持动态平衡的，直链未形成闭合 的环而被保护，导致G-四链体序列并不全是靶分子打开第一个发夹而释放、进而与第二个 发夹杂交形成的，也有部分是直链的序列与第二个发夹直接杂交，从而形成自由的G-四链 体序列的，因此无法实现较为灵敏的检测。
[0005] 鉴于此，目前亟待提出一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测DNA的探 针。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中的DNA分子检测探针的高成本、 耗时长、选择性低、受限于检测条件的问题，进而提供一种检测成本低、检测简单快捷的DNA 分子检测探针。
[0007] 本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA 酶的探针灵敏度低、背景噪声大，进而提供一种高灵敏度、低背景噪声的基于双重信号扩增 的探针。
[0008] 本发明的基于双重信号扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹、第三发 夹、第四发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹、第四发夹均为单链线形分子自身回 折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未 形成双链结构并回折的部分为环状区。
[0009] 所述第一发夹包括：可特异性识别目标DNA的识别区、使所述第一发夹与第二发 夹形成双链体的第一碱基互补区；
[0010] 所述第二发夹包括：与所述第一发夹的所述识别区部分杂交的第二碱基互补区、 与所述第一发夹的所述第一碱基互补区部分杂交的第三碱基互补区，以及与所述第三发夹 部分杂交的第四碱基互补区；
[0011] 所述第三发夹包括：与所述第二发夹的所述第四碱基互补区部分杂交的第五碱基 互补区、与所述第四发夹部分杂交的第六碱基互补区，以及第一 G-四链体序列区；
[0012] 所述第四发夹包括：与所述第三发夹的所述第五碱基互补区部分杂交的第七碱 基互补区、与所述第三发夹的所述第六碱基互补区部分杂交的第八碱基互补区，以及第二 G-四链体序列区。
[0013] 发夹结构是指，DNA单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而 形成的结构。本发明中，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹的环状区是指，在发 夹结构中，未形成双链结构的、回折的部分。所述茎干区是指，形成双链结构的部分。
[0014] 进一步地，所述第一 G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列区以及G-四 链体序列的1/4段序列区组成；所述第二G-四链体序列区由G-四链体序列的3/4段序列 区以及G-四链体序列的1/4段序列区组成。
[0015] 进一步地，所述第三发夹的一端部为所述第一 G-四链体序列区的所述G-四链体 序列的3/4段序列区、并依次连接有所述第六碱基互补区、第五碱基互补区、以及设置在另 一端的所述第一 G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列；
[0016] 所述第四发夹的一端部为所述第二G-四链体序列区的所述G-四链体序列的3/4 段序列区、并依次连接有第七碱基互补区、第八碱基互补区、以及设置在另一端的所述第二 G-四链体序列区的所述G-四链体序列的1/4段序列。
[0017] 所述第三发夹的第一 G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如 SEQ ID No. 1 所示的序列结构，序列 SEQ ID No. 1 为：5' -AGG GCG GGT GGG T-3'；G-四链 体序列的1/4段序列区具有如SEQ ID No. 2所示的序列结构，序列SEQ ID No. 2为：5' -T GGG T-3' ；
[0018] 所述第四发夹的第二G-四链体序列区的G-四链体序列的3/4段序列区具有如 SEQ ID No. 3所示的序列结构，序列SEQ ID No. 3为：5' -TGG GT-3'；G-四链体序列的1/4 段序列区具有如SEQ ID No. 4所示的序列结构，序列SEQ ID No. 4为：5'-TGG GTA GGG CGG G-3'。
[0019] 所述第三发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述 第五碱基互补区部分杂交；
[0020] 所述第四发夹的G-四链体序列的3/4段序列区位于发夹结构的茎干区，并与所述 第八碱基互补区部分杂交。
[0021] 所述第一发夹具有如SEQ ID No. 5所示的序列结构，序列SEQ ID No. 5为：5'-ATG TGGAAAATCTCTAGCAGTAGAAGAAGGTGTACTGCTAGAGAITT-3' ；所述第二发夹具有如 SEQ ID No. 6 所示的序列结构，序列 SEQ ID No. 6 为：5' -TAG CAG TAC ACC ITC ITC TAC TGC TAG AGA TTTAGA AGA AGG TGT TTA AGT A-3' ；所述第三发夹具有如SEQ ID No. 7所示的序列结构， 序列 SEQ ID No. 7 为：5' -AGG GCG GGT GGG TGT TTA AGT TGG AGA ATT GTA CTT AAA CAC CTT CTTCTT GGG T-3' ；所述第四发夹具有如SEQ ID No. 8所示的序列结构，序列SEQ ID No. 8为：5'-TGG GTC AAT TCT CCA ACT TAA ACT AGA AGA AGG TGT TTA AGT TGG GTA GGG CGG G-3'。
[0022] 本发明的检测DNA分子的方法，为利用本发明所述的基于双重信号扩增的探针进 行荧光检测。
[0023] 所述方法包括以下步骤：将所述的基于双重信号扩增的探针置于待测溶液中， 25-40°C下培育l_3h，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2, 2-联氮-二（3-乙基-苯 并噻唑-6-磺酸）二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。
[0024] 本发明所述的基于双重信号扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。
[0025] 进一步地，所述DNA分子为HIV病毒DNA。
[0026] 本发明所述的基于双重信号扩增的探针的原理如下：反应体系中，四个发夹结构 (第一发夹、第二发夹、第三发夹、第四发夹）彼此共存，保持稳定的发夹构象，呈现低背景。 当所述第一发夹的识别区与目标DNA结合后，第一发夹打开，第一碱基互补区以单链形式 被释放出来，进而与第二发夹的第三碱基互补区杂交，由于复合物第一发夹-第二发夹比 复合物第一发夹-目标DNA更稳定，因此目标DNA被第二发夹通过类似DNA分支迀移的过程 替换，分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹结合，从而引发目标DNA的循环扩增；留 下的第一发夹-第二发夹双链体的触发第三发夹打开，第一发夹-第二发夹双链体的第四 碱基互补区与第三发夹的第五碱基互补区进行杂交，生成复合物第一发夹-第二发夹-第 三发夹，第三发夹的打开释放出第六碱基互补区以及第一 G-四链体序列区的3/4段序列 区，第六