理中分析的第一测定值至第三测定 值，第一测定值大于第二测定值、且第二测定值小于第三测定值时，判定药剂使细胞色素 P450的药物代谢功能恢复。用数学式表示时，成为"第一测定值>第二测定值"、且"第二测 定值<第三测定值"的情况。特别优选的是，第三测定值为第二测定值的3倍以上时，判定 使药物代谢功能恢复。其理由如上述，这是由于，为了准确地判定衰减和恢复，第二测定值 相对于第一测定值必须为显著小的值。
[0181] 实施例
[0182] 对实施例和比较例进行说明。
[0183] L细胞的准备（球状体形成处理）
[0184] [实施例]
[0185] (1-1)培养容器和细胞
[0186] 使用图8所示的具有多个孔21a的培养板la。在各孔21a的底部培养面形成有多 个培养容器l〇a。各培养容器IOa具有以当量直径D为200 μ m、高度H为100 μ m形成的培 养空间11a。另外，壁12a的宽度W为10 μ m。
[0187] 培养的细胞使用源自日本人的株化肝细胞即FLC-4细胞。
[0188] (1-2)培养容器的准备
[0189] 使用将0· 01 % MPC溶液和0· 01 %的多聚-L-赖氨酸（株式会社SMGA制造）以 9:1的比例混合而成的溶液作为涂覆剂。
[0190] 向各孔中加入涂覆溶液0. 3mL，在净化台内使其干燥。
[0191] 使用前用磷酸缓冲生理盐水（PBS:phosphate_buffered saline)清洗。
[0192] (1-3)细胞培养
[0193] 培养基使用包含10%的胎牛血清（FBS)的DMEM/F12培养基。调整细胞悬浮液，使 细胞接种密度变为16 X IO5个/mL。
[0194] 在每1个孔中加入500 μ L的细胞悬浮液。
[0195] 在CO2培养箱内培养细胞10天至11天。培养基更换3天进行1次。
[0196] 培养基更换时，不吸取全部培养基而残留约100 μ L，重新加入500 μ L的培养基。
[0197] [比较例]
[0198] 培养容器使用市售的培养面为平坦的24孔板。培养板的等级使用细胞培养等级。
[0199] 除此之外，在与实施例相同的条件下实施。
[0200] 2Α.用于评价方法研宄的试验条件（培养基抽吸处理、试验溶液添加处理、接触处 理）
[0201] 实施例、比较例均在以下条件下实施试验。
[0202] (2Α-1)步骤
[0203] 按照以下步骤处理培养的细胞。
[0204] ?用吸移管从各孔中抽吸旧的培养基的全部量（培养基抽吸处理）。
[0205] ?向各孔中添加试验溶液或对照溶液（试验溶液添加处理）。
[0206] ?在37°C、CO2培养箱内将细胞孵育8小时、24小时或48小时（接触处理）。
[0207] (2A-2)试验溶液、对照溶液的调整
[0208] 对于试验溶液，在不含血清的DMEM/F12的溶液（DMEM/E12FBS (-))中按照表1的 浓度溶解细胞因子。
[0209] 对于对照溶液，使用不含血清的DMEM/F12的溶液，将细胞因子浓度设为OmM。
[0210] (2A-3)分析
[0211] 利用表1所述的分析方法，分析CYP3A4的代谢功能。对于TNF- α，加入CYP3A4也 分析CYP2C9的功能。
[0212]
【主权项】
1. 一种评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法， 该方法使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培养容器内接触1 小时以上且小于96小时后，评价细胞色素P450的代谢功能的诱导或衰减的有无。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由所述株化肝细胞形成的球状体的直径 的平均值为50 y m以上且小于200 y m，并且具有半值宽度范围内的直径的球状体为全部球 状体的70%以上。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述试验溶液为无血清培养基。
4. 根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，以健康人的细胞因子的 血药浓度的平均值的0. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，使用所述试验溶液的细胞 因子浓度为所述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含所述细胞因子的各试验溶 液。
5. 根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其特征在于，以所述细胞因子在被分泌 的疾病患者的血药浓度的平均值的〇. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，使用所述试 验溶液的细胞因子的浓度为所述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含细胞因子 的各试验溶液。
6. 根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其特征在于，在同一孔内进行将所述株 化肝细胞培养为球状体形状的工序、和使球状体形状的所述株化肝细胞和包含所述细胞因 子的所述试验溶液接触1小时以上且小于96小时的工序。
7. 根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于，使用具有多个孔的培养板 的一个孔作为所述培养容器来进行如下工序： 在所述一个孔内，在包含10%血清的培养基中形成所述株化肝细胞的球状体的工序； 从所述一个孔吸取所述培养基的工序； 向所述一个孔中添加包含所述细胞因子的所述试验溶液的工序；和 在所述一个孔内，使包含所述细胞因子的所述试验溶液与所述球状体接触1小时以上 且小于96小时的工序。
8. 根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养容器以在具有多 个孔的培养板的各孔内具有多个培养空间的方式形成， 各培养空间为包括具有当量直径的长度的面和高度的空间，所述高度除以所述当量直 径所得的值为0.3至2的范围， 在所述培养空间的底配置有至少2个以上的所述当量直径为100 ym至1000 ym的范 围的培养空间。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多个培养空间的隔开相邻的所述培 养空间的壁的厚度为2ym至50 ym的范围。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，隔开所述培养空间的壁的上表面与 侧面所成的角度为90度至135度的范围。
11. 根据权利要求8至10中的任一项所述的方法，其特征在于，所述多个培养空间的底 的表面通过玻璃处理被处理成水接触角为45度以下。
12. 根据权利要求8至11中的任一项所述的方法，其特征在于，所述多个培养空间的底 的表面通过等离子体处理形成官能团而被处理成水接触角为45度以下。
13. 根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养容器的表面 固定化有聚合物，所述聚合物为选自通过聚合物温度、光中的任一者而亲水性和疏水性变 化的聚合物、抑制细胞粘附的亲水性的聚合物链、磷脂、磷脂-高分子复合体、聚（甲基丙烯 酸2-羟乙酯）（PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、脱乙酰壳多糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一者 或为包含其组合的聚合物。
14. 根据权利要求1至12中的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养容器的表面 固定化有聚合物的混合物，所述混合物为选自抑制细胞粘附的亲水性的聚合物链、磷脂、磷 脂-高分子复合体、聚（甲基丙烯酸2-羟乙酯）（PHEMA)、聚乙烯醇、琼脂糖、脱乙酰壳多 糖、聚乙二醇和白蛋白的组中的一者或包含它们的组合的聚合物；与促进细胞粘附性的聚 合物、即选自多聚-L-赖氨酸、多聚-L-赖氨酸、胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白中的一者 或包含它们的组合的聚合物的混合物。
15. 根据权利要求1至14中的任一项所述的方法，其特征在于，所述培养容器为由选自 丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯系树脂、丙烯酸-苯乙烯系共聚树脂、聚碳酸酯系 树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯_乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树 脂和有机硅树脂的组中的一种或它们的组合制成的树脂成型品。
16. 根据权利要求1至15中的任一项所述的方法，其特征在于，构成所述培养容器的底 部的聚合物的总透光率为85%以上且小于99%。
17. -种筛选方法，其为与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法， 准备不含所述细胞因子和所述药剂的第一试验溶液、包含所述细胞因子且不含所述药 剂的第二试验溶液、以及包含所述细胞因子和所述药剂的第三试验溶液， 使所述第一试验溶液至第三试验溶液与球状体形状的株化肝细胞在培养容器内接触1 小时以上且小于96小时， 测定与所述第一试验溶液接触的所述株化肝细胞的细胞色素P450的药物代谢酶的功 能，取得第一测定值，同样地测定与所述第二试验溶液和第三试验溶液接触的所述株化肝 细胞的细胞色素P450的药物代谢酶的功能，取得第二测定值和第三测定值， 所述第一测定值大于所述第二测定值且所述第二测定值小于所述第三测定值时，判定 所述药剂使细胞色素P450的药物代谢功能恢复。
18. 根据权利要求17所述的筛选方法，其特征在于，由所述株化肝细胞形成的球状体 的直径的平均值为50 y m以上且小于200 y m，并且具有半值宽度范围内的直径的球状体为 全部球状体的70%以上。
19. 根据权利要求17或18所述的筛选方法，其特征在于，所述试验溶液的溶剂为无血 清培养基。
20. 根据权利要求17至19中的任一项所述的方法，其特征在于，所述第三测定值为所 述第二测定值的3倍时，判定使细胞色素P450的药物代谢功能恢复。
21. 根据权利要求17至20中的任一项所述的方法，其特征在于，所述第二试验溶液和 第三试验溶液的细胞因子的浓度如下选择：使包含至少3种浓度的细胞因子且不含所述药 剂的溶液与所述株化肝细胞接触，对细胞色素P450的药物代谢酶的功能进行测定，选择所 测得的测定值小于所述第一测定值的浓度， 其中所述包含至少3种浓度的细胞因子且不含所述药剂的溶液为，以健康人的细胞因 子的血药浓度的平均值的0. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，所述第二试验溶液和 第三试验溶液的细胞因子的浓度为所述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的包含所 述细胞因子且不含所述药剂的溶液。
22.根据权利要求17至20中的任一项所述的方法，其特征在于，所述第二试验溶液和 第三试验溶液的细胞因子的浓度如下选择：使包含至少3种浓度的细胞因子且不含所述药 剂的溶液与所述株化肝细胞接触，对细胞色素P450的药物代谢酶的功能进行测定，选择所 测得的测定值小于所述第一测定值的浓度， 其中所述包含至少3种浓度的细胞因子且不含所述药剂的溶液为，以所述细胞因子在 被分泌的疾病患者的血药浓度的0. 1倍至50倍的范围中的一个浓度为基准，所述第二试验 溶液和第三试验溶液的细胞因子的浓度为所述基准的1倍、10倍、100倍至少这3种浓度的 包含所述细胞因子且不含所述药剂的溶液。
23. 根据权利要求17至22中的任一项所述的方法，其特征在于，在培养板的同一孔内 进行将所述株化肝细胞培养为球状体形状的工序、和使球状体形状的所述株化肝细胞与所 述第一试验溶液至第三试验溶液接触的工序。
【专利摘要】提供评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法；和与细胞因子相互作用的药剂的筛选方法中利用株化肝细胞的方法。评价细胞因子对细胞色素P450的代谢能力产生的影响的方法如下：使用具有培养空间(11)的培养容器(10)，培养株化肝细胞，形成球状体(9)，使球状体形状的株化肝细胞与包含细胞因子的试验溶液在培养容器内接触1小时以上且小于96小时后，评价细胞色素P450的诱导或衰减的有无。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-26, C12Q1-02
【公开号】CN104812911
【申请号】CN201380061684
【发明人】小林薫, 三村花华, 千叶宽, 江尻洋子, 细田雅也, 绫野贤
【申请人】株式会社可乐丽
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2013年9月27日
【公告号】EP2902496A1, US20150276716, WO2014050139A1