一种乳液pcr体系的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种乳液PCR体系。【
背景技术：
】[0002]乳液PCR(emulsionPCR)技术利用油包水结构作为PCR反应的微反应器，进行PCR扩增。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行PCR扩增。其关键技术是"注水到油"，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有的反应成分的水溶液注入到高速旋转的油相表面，水溶液瞬间形成数以万计个被油相包裹的小液滴。这些小液滴就形成了PCR反映空间。由于水相中的P2引物和磁珠表面的Pl引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数扩增，PCR反应结束后，Pl磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同源DNA扩增产物，每个片段扩增后产生几百万个相同的拷贝，这些拷贝也结合在磁珠上。整个文库的DNA。[0003]基于油包水的乳液系统提出一个扩增复杂DNA混合物的方案，目标分子被分割在微小的乳液液滴中并进行分别扩增，这种方法能够在低浓度目标DNA和大量的PCR循环条件下进行。每个独立的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。【
发明内容】[0004]本发明的一个目的是一种乳液PCR体系，所述PCR体系为乳液体系，包括水相、油相、表面活性剂与助表面活性剂。[0005]所述水相与油相的体积比为4:9-4:7。[0006]所述油相为DC5225C、PGFE(三聚甘油单硬脂酸酯)、DC749和矿物油中的1种或几种，优选为PGFE和DC749。[0007]所述体系中还包括保护剂，保护剂为BSA(牛血清蛋白）、人血清蛋白和聚乙二醇中的一种或几种，优选为BSA。[0008]所述BSA为经过乙酰化的、分子生物学级别的BSA。[0009]所述表面活性剂为span80、TritonX-lOO、tween80、tween60和tween20中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-100溶于水相。[0010]所述表面活性剂占体系的体积比为span802.5-5%，TritonX-1000·4-1.0%，tween800·2_0·5%，tween600·3_0·5%、tween200·2_0·8%;优选为span802·5_3·5%，TritonX-1000.7-0·9%，tween800.3-0·4%，tween600.4-0·5%和tween200.4-0·7%〇toon]所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。[0012]所述水相中含有emPCR助剂；还含有81^€61"、引物、0嫩聚合酶、(1阶1\]\%2+和水。[0013]所述水相中还包括焦磷酸酶，焦磷酸酶为热稳定焦磷酸酶（thermostablepyrophosphatase)〇[0014]所述emPCR助剂包括betaine(甜菜碱)、D-(+)trehalose(右旋海藻糖)、L-carnitine(左旋肉碱)、NP-40(乙基苯基聚乙二醇）、DTT(二硫苏糖醇）和DMSO(二甲基亚讽）中的一种或几种，优选为betaine0·4-1.0M、D_(+)trehalose0·2-0.5M、L_carnitine0·1-0·4Μ、ΝΡ-400.2-0.6%、DTTl-2.5mM和DMSO1-2.5%(其中的百分含量为体积比）。[0015]所述水为nuclease-freewater(NFW)〇[0016]所有试剂采用分析纯及其以上纯度。[0017]本发明提供的emPCR体系优化了核酸测序的体系环境，试剂的选取增加了微乳液体系的稳定性，油水比例适宜，使测序结果更精确、均一和稳定。该方案制备的微乳液体系热稳定性好，微球在液滴中分布均勾，单克隆比例高。本发明选取的表面活性剂和助剂的增溶度大，成核效率高，非常有利于提高测序的反应速率。【具体实施方式】[0018]实施例1(1)油相，混合PGFE和DC749共400μL。[0019](2)水相，【主权项】1.一种乳液PCR体系，其特征在于，所述PCR体系为乳液体系，包括水相、油相、表面活性剂与助表面活性剂。2.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述水相与油相的体积比为4:9-4:7〇3.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述油相为DC5225C、PGFE、DC749和矿物油中的1种或几种，优选为PGFE和DC749。4.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述体系中还包括保护剂。5.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述表面活性剂为span80、TritonX-lOO、tween80、tween60和tween20中的一种或几种，优选为span80、TritonX-100、tween80和tween60;在微乳液制备时，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-IOO溶于水相。6.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述表面活性剂占体系的比例为span802.5-5%,TritonX-IOO0.4-1.0%,tween800.2-0.5%,tween600.3-0.5%>tween200?2-0.8%;优选为span802.5-3.5%，TritonX-1000?7-0.9%，tween800?3-0.4%，tween600?4-0.5%和tween200?4-0.7%〇7.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述助表面活性剂为聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一种或几种。8.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述水相中含有emPCR助剂。9.如权利要求8所述的乳液PCR体系，其特征在于，所述emPCR助剂包括betaine、D-(+)trehalose、L_carnitine、NP-40、DTT和DMSO中的一种或几种，优选为betaine、D_(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT和DMSO010.如权利要求1所述的乳液PCR体系，其特征在于，体系中所有试剂采用分析纯及其以上纯度。【专利摘要】本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种乳液PCR体系。该乳液PCR体系由水相、油相、表面活性剂与助表面活性剂组成。本发明提供的emPCR体系优化了核酸测序的体系环境，试剂的选取增加了乳液体系的稳定性，使测序结果更精确、均一和稳定。该方案制备的乳液体系热稳定性好，微球在液滴中分布均匀，单克隆比例高。【IPC分类】C12N15-10【公开号】CN104862304【申请号】CN201510299698【发明人】蔡亦梅,高静,徐潇,吴超,张睿,王者馥,王绪敏,殷金龙,任鲁风【申请人】北京中科紫鑫科技有限责任公司【公开日】2015年8月26日【申请日】2015年6月4日