一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 他莫昔芬（tamoxifen，ΤΑΜ)作为一种雌激素受体调节的药物，在临床上常用于乳 腺癌的辅助治疗、化疗等环节，能有效降低雌激素受体（ER)阳性乳腺癌患者的死亡率，提 高其生活质量。TAM结构与雌激素相似，存在Z型和E型2个异构体。Z型异构体进入细 胞内，与ER竞争结合，形成受体复合物，阻止雌激素作用的发挥，从而抑制乳腺癌细胞的增 殖。
[0003] CYP2D6 (cytochrome P450, family2, subfamily D, polypeptide6)为细胞色素 P450酶系亚族蛋白。CYP2D基因存在于第22号染色体上，由CYP2D6、CYP2D7P、CYP2D8P组 成，其中CYP2D7P和2D8P是假基因，只有CYP2D6基因能够在肝脏及其它组织中表达，发挥 代谢作用。
[0004] TAM在体内的代谢由多种药物代谢酶参与。大约90%的TAM由CYP3A4/5灭活代 谢成为N-去甲基TAM(血浆中的主要代谢产物），另外10%TAM由CYP2D6激活代谢则转化 为4羟基-TAM，一种与ER的亲和力是TAM的5-100倍的代谢产物。N-去甲基TAM和4羟 基-TAM分别由CYP2D6和CYP3A4/5代谢为4-羟基-N-去甲基TAM (endoxifen)。最终4羟 基-TAM和endoxifen均由磺酰基转移酶（SUL TlAl)结合后排出体外。Endoxifen(4-羟 基-N-去甲基TAM (endoxifen)是一个抗雌激素活性与4-羟基TAM相当但血浆稳态浓度是 其10倍的代谢产物。由于它的形成依赖于CYP2D6,所以CYP2D6的基因多态性对TAM代谢 和临床疗效有重要意义。
[0005] 临床研究表明，CYP2D6基因第100位碱基的OT突变(又称1000T点突变)和775 位碱基A的缺失(又称775delA突变）可以导致酶活性显著下降。
[0006] 个体基因的差异是一种普遍现象，所以个体化给药不仅是势在必行，而且必须从 基因差异入手，采用药物基因组学的方法。药物基因组学通过对病人的基因检测，如对一些 疾病相关基因的SNP检测，进而对特定药物具敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP差异检 测，指导临床开出"基因合适"的药方，使患者得到最佳治疗效果，从而达到真正"用药个体 化"的目的。在分子诊断水平上建立以PCR为基础的基因型分析方法，在治疗病人各种疾病 前检测其基因型，更精确地选择适当的治疗药物和合适的剂量以减少不良反应的发生，对 病人的治疗具有很大的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。
[0008] 本发明保护一种引物组，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列表的 序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由 序列表的序列3所不的单链DNA分子和序列表的序列4所不的单链DNA分子组成。
[0009] 本发明还保护所述引物组在制备用于鉴定CYP2D6基因的1000 T点突变和CYP2D6 基因的775delA突变的试剂盒中的应用。
[0010] 本发明还保护所述引物组在制备用于指导他莫昔芬用药的试剂盒中的应用。
[0011] 本发明还保护一种用于鉴定CYP2D6基因的1000 T点突变和CYP2D6基因的 775delA突变的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒还可包括阳性对照质粒。所述阳性对 照质粒可为将具有CYP2D6基因的1000 T点突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒 甲和将具有CYP2D6基因的775delA突变的DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒乙。所 述重组质粒甲具体可为将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pMDlS-T质粒的多克隆 位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述重组质粒乙具体可为将序 列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶 切位点之间)得到的重组质粒。所述试剂盒还可包括阴性对照。所述阴性对照具体可为水， 如去离子水。所述试剂盒还可包括用于提取基因组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可 包括用于进行DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
[0012] 本发明还保护一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒，包括所述引物组。所述试剂 盒还可包括阳性对照质粒。所述阳性对照质粒可为将具有CYP2D6基因的1000 T点突变的 DNA分子插入出发质粒得到的重组质粒甲和将具有CYP2D6基因的775delA突变的DNA分 子插入出发质粒得到的重组质粒乙。所述重组质粒甲具体可为将序列表的序列5所示的双 链DNA分子插入pMD18-T质粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重 组质粒。所述重组质粒乙具体可为将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMDlS-T质 粒的多克隆位点（如SmaI和HindIII酶切位点之间）得到的重组质粒。所述试剂盒还可包 括阴性对照。所述阴性对照具体可为水，如去离子水。所述试剂盒还可包括用于提取基因 组DNA的试剂或试剂盒。所述试剂盒还可包括用于进行DNA测序的试剂、试剂盒或仪器。
[0013] 以上任一所述的CYP2D6基因的1000 T点突变的具体含义为：序列表的序列5所 示DNA分子自5'末端第117位核苷酸由C突变为T。以上任一所述的CYP2D6基因的1000 T 点突变的具体含义为：以人的基因组DNA为模板，采用所述引物对甲进行PCR扩增，PCR扩 增产物自5'末端第117位核苷酸由C突变为T。
[0014] 以上任一所述的CYP2D6基因的775delA突变的具体含义为：序列表的序列7所 示DNA分子自5'末端第325位核苷酸（A)缺失（即序列7所示DNA分子突变为序列6所示 DNA分子)。以上任一所述的CYP2D6基因的775delA突变的具体含义为：以人的基因组DNA 为模板，采用所述引物对乙进行PCR扩增，PCR扩增产物自5'末端第325位核苷酸(A)缺失 (即序列7所示DNA分子突变为序列6所示DNA分子)。
[0015] 以人基因组DNA为模板，采用所述引物对甲或所述引物对乙进行PCR扩增，特异性 良好，不会交叉扩增人类基因组其他区域。
[0016] 本发明提供的试剂盒可用于检测与他莫昔芬敏感性相关的两个SNP位点，进而可 以用于临床指导他莫昔芬的个体化使用，提高临床治疗的针对性和可预见性。应用本发明 提供的试剂盒进行检测，具有稳定性高、操作简便、成本低廉、结果准确、可实现高通量等优 点。本发明的试剂盒能够实现产业化，能够满足临床检验试剂工作的要求，利于实现安全合 理有效的他莫昔芬用药个体化给药。
【附图说明】
[0017] 图1为引物对甲的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
[0018] 图2为引物对乙的灵敏度检测中的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0019] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。PMD18-T质粒(又称PMD18-T载体):TaKaRa公司，产品目录 号为6011。
[0020] 实施例1、特异引物对、阳性对照和阴性对照的制备
[0021] 一、特异引物对的制备
[0022] 用于检测CYP2D6基因的1000 T点突变的特异引物对由Fl和Rl组成。
[0023