] Fl (序列表的序列 1) :5' -TTGGTAGTGAGGCAGGTAT-3' ；
[0024] Rl (序列表的序列 2) :5' -ACTCAGGACTAACTCATCTTC-3'。
[0025] 用于检测CYP2D6基因的775delA突变的特异性引物对由F2和R2组成。
[0026] F2 (序列表的序列 3) :5' -GACTCTGTACCTCCTATCCA-3' ；
[0027] R2 (序列表的序列 4) :5' -AGCCACTCTCACCTTCTC-3'。
[0028] 用于检测CYP2D6基因的1000 T点突变的特异引物对又称为引物对甲（靶序列为 531bp)。用于检测CYP2D6基因的775delA突变的特异性引物对又称为引物对乙(靶序列为 405bp 或 404bp)。
[0029] 分别合成引物对甲和引物对乙。
[0030] 二、阳性对照的制备
[0031] 将序列表的序列5所示的双链DNA分子插入pMD18-T质粒的SmaI和HindIII酶 切位点之间，得到阳性对照质粒甲。
[0032] 将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入pMD18_T质粒的SmaI和HindIII酶 切位点之间，得到阳性对照质粒乙。
[0033] 三、阴性对照
[0034] 阴性对照为去离子水。
[0035] 实施例2、特异引物对的灵敏度检测
[0036] -、引物对甲的灵敏度检测
[0037] 以阳性对照质粒甲为模板，采用引物对甲进行PCR扩增。
[0038] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1。PCR扩增体系含0. 5 μ M F1、0. 5 μ M Rl和IU热 启动 DNA 聚合酶。PCR 扩增体系分别含有 lOng/μ l、5ng/y l、2.5ng/y lUng/μ l、0.5ng/ μ 1、0· 25ng/y 1、0· lng/μ 1 或 0· 05ng/y 1 阳性对照质粒甲。
[0039] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0040] 将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。图1中，tl至t8依次代 表阳性对照质粒甲的浓度为 IOng/ μ l、5ng/ μ 1、2. 5ng/ μ 1、Ing/ μ 1、0. 5ng/ μ 1、0. 25ng/ μ 1、0. lng/μ I或0.05ng/l·! I的体系。结果表明，引物对甲的灵敏度为lng/μ 1。
[0041] 分别回收各个目的条带并进行测序，结果准确。
[0042] 二、引物对乙的灵敏度检测
[0043] 以阳性对照质粒乙为模板，采用引物对乙进行PCR扩增。
[0044] PCR扩增体系的总体积为25 μ 1。PCR扩增体系含0. 5 μ M F2、0. 5 μ M R2和IU热 启动 DNA 聚合酶。PCR 扩增体系分别含有 50ng/y l、25ng/y l、15ng/y l、10ng/y l、8ng/ μ l、5ng/y 1、2· 5ng/y I 或 lng/μ I 阳性对照质粒乙。
[0045] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0046] 将PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。图2中，Tl至T8依次代 表阳性对照质粒乙的浓度为 50ng/y l、25ng/y l、15ng/y lUOng/μ l、8ng/y l、5ng/y 1、 2. 5ng/y I或lng/μ I的体系。结果表明，引物对乙的灵敏度为lng/μ 1。
[0047] 分别回收各个目的条带并进行测序，结果准确。
[0048] 实施例3、特异引物对的应用
[0049] 1、米集8位知情同意的志愿者的血样，提取基因组DNA。
[0050] 2、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增(初始 PCR扩增体系中，基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒甲代替基因组DNA的阳 性对照处理，设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照处理。
[0051] PCR扩增体系的总体积25μ 1，含0. 5μΜ F1、0. 5μΜ Rl和IU热启动DNA聚合酶。
[0052] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0053] 3、分别以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，采用引物对乙进行PCR扩增(初始 PCR扩增体系中，基因组DNA的含量为30ng);设置用阳性对照质粒乙代替基因组DNA的阳 性对照，设置用阴性对照代替基因组DNA的阴性对照。
[0054] PCR扩增体系的总体积25 μ 1，含0. 5 μ M F2、0. 5 μ M R2和IU热启动DNA聚合酶。
[0055] PCR扩增的程序均为：95°C 5分钟；95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 30秒，30个循环； 72°C 10 分钟；15°C，保持。
[0056] 4、将步骤2和步骤3的PCR扩增产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后回收目标 条带并测序。各个样本均显示单一的扩增条带，且经测序扩增产物均为目标序列，也就是说 对于人基因组来说，引物对的特异性良好，不存在非特异性扩增。阳性对照质粒均与预期结 果一致，阴性对照均未显示任何PCR扩增条带。
[0057] 各个志愿者的基因型结果见表1。
[0058] 表1各个志愿者的基因型结果代表缺失）
[0059]
【主权项】
1. 引物组，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列表的序列1所示的单链 DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列表的序列3所 不的单链DNA分子和序列表的序列4所不的单链DNA分子组成。
2. 权利要求1所述引物组在制备用于鉴定CYP2D6基因的1000 T点突变和CYP2D6基 因的775deIA突变的试剂盒中的应用。
3. 权利要求1所述引物组在制备用于指导他莫昔芬用药的试剂盒中的应用。
4. 一种用于鉴定CYP2D6基因的1000 T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂 盒，包括权利要求1所述引物组。
5. -种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒，包括权利要求1所述引物组。
【专利摘要】本发明公开了一种用于指导他莫昔芬用药的试剂盒。本发明保护一种引物组，由引物对甲和引物对乙组成；引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。本发明还保护一种用于鉴定CYP2D6基因的100C>T点突变和CYP2D6基因的775delA突变的试剂盒，包括所述引物组。本发明提供的试剂盒可用于检测与他莫昔芬敏感性相关的两个SNP位点，进而可以用于临床指导他莫昔芬的个体化使用，提高临床治疗的针对性和可预见性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104862308
【申请号】CN201410066908
【发明人】文洁
【申请人】文洁
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月26日